깨어 마우스의 신경 활성 물질의 Microiontophoretic 응용 프로그램과 결합하여 신경 활동의 세포 외 기록

요약

깨어 있는 쥐의 기록 부위 부근에서 세포 외 신경 활동을 동시에 기록하고 여러 신경 활성 물질을 방출하는 전극 구성 방법을 제시합니다. 이 기술을 사용하면 관심 있는 뉴런에 대한 추정 국소 시냅스 입력값을 자세히 분석할 수 있습니다.

초록

신경 전달 물질과 신경 조절, 결과적으로 다른 신경 반응의 활성의 차이는 마취 웨이크 동물 사이에서 발견 될 수있다. 따라서, 웨이크 동물의 시냅스 시스템의 조작을 허용하는 방법에 의해 영향을받지 마취제 신경 처리 시냅스 입력의 기여도를 결정하기 위해 요구된다. 여기서는 동시에 신경 세포 활성을 기록하고 깨어 마우스에서의 기록 위치의 근방에 여러 신경 활성 물질을 방출하는 전극의 구성에 대한 방법을 제시한다. 이 절차를 결합함으로써, 우리는 선택적으로 머리를 억제 마우스의 열등한 둔덕의 뉴런에서 GABA _{A를 수용체를} 차단하는 gabazine의 microiontophoretic 주사를 시행 하였다. Gabazine는 성공적 주파수 응답 영역과 자극 특정 적응 같은 신경 응답 특성을 개질. 따라서, 우리는 우리의 방법이 recordin에 적합하다는 것을 입증g 단일 유닛 활동 및 청각 처리에서 특정한 신경 전달 물질 수용체의 역할에 대한 해부.

상술 한 절차의 주요 한계는 기록 세션 동물의 습관화의 레벨에 의해 결정되는 상대적으로 짧은 기록 시간 (~ 3 시간)이다. 한편, 복수의 기록 세션은 동일한 동물에서 수행 될 수있다. 신경 전달하거나 (예컨대 전신 주사 또는 optogenetic 모델의 사용 등) neuromodulation 레벨을 조작하는 데 사용되는 다른 실험 절차를 통해이 기술의 이점은 약물의 효과는 표적 뉴런 로컬 시냅스 입력에 한정된다는 점이다. 또한, 전극의 주문 제작은 신경 구조 (예 레코딩의 신호 대 잡음비를 향상시키는 팁 저항과 같은) 관심있는 신경 세포의 종류에 따라 특정의 파라미터 조정을 허용한다.

서론

신경 자극과 억제의 상호 작용은 감각 정보 ^(1)의 처리를 위해 필수적입니다. 또한 마취 피질 활성화 및 ^2,3- 시냅스 입력의 시간적 패턴의 역학에 강한 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 예를 들면, 마취제는 피질 뉴런 ^3,4-에서 시각 유발 반응의 지속 기간을 변경하는 것이 관찰되었다. 또한, 흥분 및 억제 성 시냅스 입력 사이의 비율이 모두 유발 변경 및 운동량 속도 ^-6,7- 마취 깨어 동물 ^4,5- 다르다. 각성시, 억제가 여기보다 더 강한 반면 시냅스 컨덕턴스를 측정함으로써, 하이더와 동료 ⁴ 마취 진폭이 억제 일치 여기를 발견했다. 이러한 결과는 웨이크 동물의 감각 처리 시냅스 특정 입력의 효과를 연구하기 위해 실험 절차의 개발 프롬프트.

(NA 정도의) 작은 전류 주사를인가함으로써 대전 신경 활성 물질의 제어 방출 광범위 시냅스 입력 기여 감각 처리 ^8-13에서 추정되는 세포 수용체의 역할을 연구하기 위해 사용되어왔다 . microiontophoresis 알려진 이러한 기술은 신속하고 밀폐 효과에 기여하는 기록 된 뉴런의 근방에서 약물의 적용을 허용한다. 이 절차는 전신 주사, 미세 투석....

프로토콜

모든 실험 절차의 승인 살라망카 대학에서 수행하고 있었다의 기준에 부합하는 방법을 사용하여, 살라망카 동물 관리위원회의 대학뿐만 아니라 유럽 연합 (EU)의 기준 (지침 63분의 2,010 / EU)에 대한 신경 연구에서 동물의 용도.

1. 텅스텐 전극

주 :. 텅스텐 전극의 제조 및 메릴 워스 ²⁷ 워스 외 ^(28)에서 설명한 기존의 기술에 기초하여 수소 등 ^17에 기재된 작업 환경 설정을 이용하여 수행된다..

1. 2.5 MΩ - IC 신경 세포의 단일 단위 세포 활동을 기록하기 위해, 1.5의 팁 임피던스 전극을 사용합니다. 상세한 설명은 전술 한 참고 문헌에서 발견되기 때문에, 여기서, 텅스텐 전극을 제조하는 단계는, 간략하게 설명된다.
2. 맞춤 제작 정렬 텅스텐 와이어를 배치도구 (도 1a)는 원하는 길이로 절단 보조한다. 정렬 도구는 전선에 ~ 40mm의 길이를 제한하는 일단 정지하여, 2mm의 간격으로 평행하게 접착 (30)의 바늘 (25 G)로 구성된다. 조심스럽게 접착 테이프로 전선의 느슨한 끝을 부착, 강한 가위 와이어의 나머지 부분을 잘라.
3. 모든 와이어 테이프에....

결과

우리는 IC의 4 잘 격리 된 신경 세포의 단일 유닛 활동을 기록했다. 웨이크 마우스 세포 외 기록시 얻어진 전형적인 신호대 잡음비는도 3b에 도시된다.도 4a는 전 및 GABA _(A)의 봉쇄 gabazine으로 -receptors 동안 각 뉴런의 주파수 응답 영역 (FRA)을 나타낸다. 반응 강도 (스파이크 / 자극)뿐만 아니라 스펙트럼 조정의 폭이 넓어의 증가가 관찰되었다. 유발 된 반응의 증가 (그림 4B) 제시되는 모든 주파수와 강도에 신경 응답에서 얻은 축적 된 요정 - 자극 시간 히스토그램도 분명했다.

신경 세포의 FRA (그림 4A에서 십자가) 내에서 주파수의 하나 또는 두 개의 쌍의에, 괴짜 패러다임에 반복.......

토론

깨어있는 동물의 신경 활성 물질의 microiontophoresis는 프로브 및 단일 뉴런 ^{40, 41의} 활동에 특정 시냅스 입력의 역할을 해부 할 수있는 강력한 기술이다. 더 중요한 것은,이 절차는 마취제의 잠재적 인 간섭없이 신경 회로의 신경 전달 물질과 신경 조절의 영향의 결정을 할 수 있습니다. 여기서는 웨이크 마우스의 IC에 gabazine의인가 견고 주파수 튜닝 (도 4A)에서, 시간 응답 패턴 (도 4B)과 SSA (도 5)으로 변경 보여준다.

상술 한 절차의 주요 한계는 기록 세션 동물의 습관화의 레벨에 의해 결정되는 상대적으로 짧은 기록 시간 (~ 3 시간)이다. 한편, 복수의 기록 세션은 동일한 동물에서 수행 될 수있다. microiontophoresis을가 얼마나 불분명되어 사용인가 된 신경 활성 물질이 주변 조직으로 확산. 따라서, 신경 네트워크.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
텅스텐 와이어	Harvard Apparatus LTD	33-0099	0.005 인치 x 3 인치
보로실리케이트 유리 모세관	Harvard Apparatus LTD	30-0053	보로실리케이트 표준 벽, 필라멘트 없음, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm 길이
멀티배럴 유리 캐필러리	세계 정밀 기기	5B120F-4	5배럴 모세관, 길이 4인치, 1.2mm OD, 필라멘트 포함
Diaplus	DiaDent	2001-2101	광경화 접착제, 텅스텐 전극을 유리 멀티배럴 피펫에 부착하는 데 사용
G-Bond	GC Corporation	2277	광경화 접착제, 동물의 두개골에 헤드포스트를 부착하는 데 사용
Charisma	Heraeus Kulzer	66000087	광경화 복합재, 두개
Araldit Cristal과 헤드포스트의 결합을 강화하는 데 사용	Ceys		2 성분 expoxy, 텅스텐 전극의 부착을 더욱 확보하는 데 사용 유리 멀티 배럴 피펫
가열 담요	Cibertec	RTC1
Stereotactic frame	Narishige	SR-6N	마우스 용 수정
Microiontophoretic device	Harvard Apparatus LTD	Neurophore BH-2	IP-2 이온 영동 펌프(각 약물 전달 채널에 하나씩) 및 밸런스 모듈 포함
다중 배럴 유리 피펫 풀러	Narishige	모델, PE-21
LED 램프	, Technoflux	CV-215	5W, 430-485nm,
MicroFil	World Precision Instruments	MF34G-5	유연한 플라스틱 바늘, 34AWG
Imalgene	Merial		Ketamine, 100mg/mL
Rompun	Bayer		Xylazine, 20 mg/mL
Gabazine / SR-95531	Sigma	S106	준비 ~ 1000µ 증류수에 20mM 가바진을 넣고 pH를 4로 조정합니다.

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