Een methode te richten en te isoleren Airway-innerveren sensorische neuronen in Muizen
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
Somatosensorische zenuwen transduceren thermische, mechanische, chemische en schadelijke stimuli door zowel endogene als milieufactoren. De cel lichamen van deze afferente neuronen bevinden zich in de sensorische ganglia. Sensorische ganglia innerveren een specifiek orgaan of deel van het lichaam. Bijvoorbeeld, de dorsale wortel ganglia (DRG) bevinden zich in de wervelkolom en uitbreiden processen in het lichaam en ledematen. De nervus ganglia bevinden zich in de schedel en innerveren het gezicht, en de bovenste luchtwegen. Vagale afferente vezels van de nodose ganglia zich over de gehele darmen, hart en longen. De nodose neuronen onder controle van een divers scala aan functies, zoals: ademhaling, irritatie van luchtwegen en hoest reflexen. Zo begrijpen en hun functie te manipuleren, is het essentieel om de luchtwegen specifieke neuronale subpopulaties identificeren en te isoleren. Bij de muis, worden de luchtwegen blootgesteld aan een fluorescerende tracer kleurstof, Fast Blue voor retrograde traceren van luchtweg-specifieke nodosus neurons. De nodose ganglia worden gescheiden en fluorescentie geactiveerde cel (FAC) sortering wordt gebruikt om kleurstof positieve cellen te verzamelen. Vervolgens wordt hoogwaardige ribonucleïnezuur (RNA) geëxtraheerd uit kleurstof positieve cellen voor de volgende generatie sequencing. Deze methode luchtwegen specifieke neuronale genexpressie bepaald.
Introduction
Somatosensorische zenuwen transduceren thermische, mechanische, chemische en schadelijke stimuli door zowel endogene als milieufactoren. De cellichamen van deze afferente neuronen zijn in sensorische ganglia, zoals de dorsale wortel, trigeminale of knobbelige ganglia. Elke sensorische ganglion innerveert specifieke gebieden van het lichaam en bevat cellen die afzonderlijke organen en weefsels innerveren binnen dat gebied. Bijvoorbeeld, de dorsale wortel ganglia (DRG) bevinden zich in de wervelkolom en uitbreiden processen in het lichaam en ledematen, terwijl de trigeminale ganglia liggen in de schedel, bevattende neuronen dat het gezicht, ogen, meninges of bovenste luchtwegen 1 innerveren, 2. De nodose ganglia van de vagus zenuw in de hals onder de schedel en bevat cellichamen die zenuwvezels uitstrekken door het gehele maagdarmkanaal, hart en onderste luchtwegen en longen 3. Bij mensen staat de knobbelige ganglion alleen is echter in de muis is gefuseerdde jugularis ganglion, die ook innerveert de longen 4. Deze gefuseerde ganglion wordt vaak de jugulaire / nodose complex vagale ganglion of gewoon knobbelige ganglion 5. Hier wordt aangeduid als de knobbelige ganglion.
Afferente vezels van de nodose gegevens doorgeven van de ingewanden naar de kern van de solitaire zenuwvezelstreng (NTS) in de hersenstam. Zintuiglijke dit unieke ganglion stuurt een verscheidenheid aan functies, zoals darmmotiliteit 6, 7 hartslag, ademhaling 8,9 en irriterend geactiveerde respiratoire respons 10,11. Met deze verscheidenheid aan functies en geïnnerveerde organen, is het essentieel te richten en te isoleren orgaan-specifieke subpopulaties van de knobbelige ganglion om afzonderlijke zenuwbanen bestuderen. Echter, gezien de geringe omvang van de nodose en het beperkte aantal neuronen die het bevat dit is geen sinecure. Elke muis knobbelige ganglion bevat ongeveer 5.000 neuronen 12naast een uitgebreide populatie ondersteunen satellietcellen. Van de 5000 nodose neuronen, slechts 3-5% innervate de luchtwegen. Daarom is elke functionele, morfologische of moleculaire veranderingen binnen de luchtweg-zenuwcellen, als gevolg van respiratoire stimulatie of pathologieën, gaan verloren in de dicht op elkaar gepakte knobbelige ganglion.
Om dit probleem op te lossen, werd een werkwijze ontwikkeld voor het identificeren en isoleren van neuronen die de luchtwegen innerveren. De luchtwegen werden blootgesteld aan een fluorescerende tracer kleurstof de volgende innerverende nodose neuronen te identificeren. Fast Blue werd opgepikt door neuronen en reist snel hun cellichamen waar het wordt bewaard tot acht weken 13-15. Eenmaal geïdentificeerd, een zachte, maar efficiënte, dissociatie protocol werd gebruikt om kleurstof etikettering en de levensvatbaarheid van de cellen te behouden voor fluorescentie geactiveerde cel (FAC) sorteren. Gesorteerde cellen worden gebruikt om hoge kwaliteit ribonucleïnezuur (RNA) extract genexpressie of f bepalenof andere stroomafwaartse moleculaire analyse. Dit protocol biedt een nuttige en robuuste techniek voor het isoleren van sensorische neuronen die een weefsel van belang innerveren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor luchtweg-zenuwcellen gericht in de nodose ganglia van de nervus vagus. Eenmaal gelabeld, worden de ganglia voorzichtig los om optimaal te behouden cel aantallen en de levensvatbaarheid. Deze neuronen zijn dan FAC gesorteerd direct in lysis buffer en RNA geëxtraheerd. De betekenis van dit protocol is de mogelijkheid te richten, isoleren en bewaren van de kwaliteit van een organoleptische celpopulatie. Genexpressie wordt in dit kleine populatie van neuronen en orgaan-specifieke …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteund door NIH-subsidie R01HL105635 te SEJ. De auteurs willen graag bedanken Diego V. Bohórquez voor technisch advies. We danken ook R. Ian Cumming voor technische bijstand en het uitvoeren van de flowcytometrie in het Duke Human Vaccin Instituut Onderzoek flowcytometrie Shared Resource Facility (Durham, NC). Flowcytometrie werd uitgevoerd in het Regionaal Biocontainment Laboratory van Duke, die gedeeltelijke ondersteuning voor de bouw van de National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (UC6-AI058607) ontvangen.
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. 신경과학. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. 신경과학. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol – Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -. Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
