En metode for å målrette og isolere Airway-innervating sensoriske nevroner i Mus
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
Somatosensoriske nerver transduce termisk, mekanisk, kjemisk, og skadelige stimuli forårsaket av både endogene og miljøagenter. Cellen likene av disse afferente nerveceller ligger innenfor sensoriske ganglier. Sensoriske ganglia innerverer et bestemt organ eller en del av kroppen. For eksempel, er den dorsale rotganglier (DRG) som befinner seg i ryggsøylen og forlenge prosesser i hele kroppen og lemmene. Trigeminal ganglia er plassert i hodeskallen og innerverer ansikt, og øvre luftveiene. Vagale afferente av nodose ganglia forlenge gjennom gut, hjerte og lunger. De nodose nevroner styre et variert utvalg av funksjoner som: respirasjonsfrekvens, luftveisirritasjon og hoste reflekser. Således, for å forstå og manipulere deres funksjon, er det avgjørende å identifisere og isolere luftveis spesifikke nevronale sub-populasjoner. I mus, blir luftveiene utsettes for et fluoriserende spor fargestoff, Hurtig Blått, for retrograd sporing av luftvei-spesifikk nodose neurons. De nodose ganglia blir dissosiert og fluorescens-aktivert celle (FAC) sortering brukes til å samle fargestoff-positive celler. Deretter er høy kvalitet ribonukleinsyre (RNA) hentet fra fargestoff positive celler for neste generasjons sekvensering. Ved hjelp av denne fremgangsmåten luftvei spesifikke nevronale genekspresjon blir bestemt.
Introduction
Somatosensoriske nerver transduce termisk, mekanisk, kjemisk, og skadelige stimuli forårsaket av både endogene og miljøagenter. De cellelegemer av disse afferente nerver er lokalisert i sensoriske ganglier, slik som dorsal root, trigeminal eller nodose ganglia. Hver sensorisk ganglion innervates spesifikke regioner av kroppen og inneholder celler som innerverer separate organer og vev i denne regionen. For eksempel, er den dorsale rotganglier (DRG) som befinner seg i ryggsøylen og forlenge prosesser i hele kroppen og lemmene, mens trigeminal ganglia er plassert i hodeskallen, inneholdende neuroner som innerverer de ansikt, øyne, hjernehinnene eller øvre luftveier 1, 2. Den nodose ganglia av vagus nerve ligger i halsen under hodeskallen og inneholder cellelegemer som går nervefibre gjennom mage-tarmkanalen, hjerte og nedre luftveier og lunger 3. Hos mennesker den nodose ganglion står alene, men i musen er det smeltetmed jugularis ganglion, som også innervates lungene 4. Dette smeltet ganglion kalles ofte vena / nodose kompleks, vågal ganglion, eller rett og slett nodose ganglion 5. Her er det referert til som nodose ganglion.
Afferente fibrene i nodose overføre informasjon fra innvollene til kjernen av den ensomme tarmkanalen (NTS) i hjernestammen. Sanseinntrykk til denne unike ganglion styrer et variert utvalg av funksjoner, for eksempel tarmmotilitet 6, puls 7, respirasjon 8,9, og etse-aktivert respiratorisk respons 10,11. Med denne mangfold av funksjoner og innerverte organer, er det avgjørende å målrette og isolere organspesifikke subpopulasjoner av den nodose ganglion for å studere de enkelte nervebaner. Imidlertid, gitt den lille størrelsen av nodose og det begrensede antall av neuroner det inneholder dette er ikke en triviell oppgave. Hver mus nodose ganglion inneholder omtrent 5000 nevroner 12i tillegg til en omfattende befolknings støtte satellittceller. Av de 5000 nodose nevroner, kun 3-5% innerverer luftveiene. Derfor er funksjonelle, morfologiske eller molekylære endringer i luftveis-innervating nevroner, på grunn av luft stimulering eller patologi, vil gå tapt i tettpakket nodose ganglion.
For å løse dette problemet, ble det utviklet en metode for å identifisere og isolere nevroner som innerverer luftveiene. Luftveiene ble utsatt for et fluoriserende spor fargestoff for å identifisere de etterfølgende innervating nodose neuroner. Fast Blå ble plukket opp av nevroner og reiser raskt til sin celle organer der det er beholdt i opptil åtte uker 13 – 15. Når identifisert, en mild, men effektiv, dissosiasjon protokollen ble brukt til å bevare fargestoff merking og celleviabilitet for fluorescerende aktivert celle (FAC) sortering. Sorterte cellene brukes til å ekstrahere høy kvalitet ribonukleinsyre (RNA) for å bestemme genekspresjon eller feller andre nedstrøms molekylær analyse. Denne protokollen gir en nyttig og robust teknikk for å isolere sensoriske nevroner som innerverer en vev av interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for å målrette luftvei-innervating nevroner i nodose ganglia av nervus vagus. Når merket, blir ganglia forsiktig dissosiert til optimalt bevare celle tall og levedyktighet. Disse nervecellene er så FAC sortert direkte i lysebuffer og RNA er hentet. Betydningen av denne protokollen er evnen til å målrette, isolere og bevare kvaliteten på en bestemt sansecellepopulasjon. Genekspresjon er beskrevet i dette liten populasjon av neuroner, og organspesifikke funksjoner og nevrale ne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttet av NIH gi R01HL105635 til SEJ. Forfatterne ønsker å takke Diego V. Bohórquez for teknisk rådgivning. Vi takker også R. Ian Cumming for teknisk assistanse og utførelse av flowcytometri ved (Durham, NC) hertugen Menneskelig Vaccine Institute Forskning flowcytometrisystemer Shared Resource Facility. Flowcytometri ble utført i Regional Biocontainment Laboratory ved Duke som fikk delvis støtte for bygging fra National Institutes of Health, National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (UC6-AI058607).
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. 신경과학. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. 신경과학. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol – Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -. Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
