Um método para alvejar e Isolar Airway-inervação neurônios sensoriais em Ratos
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
nervos Somatosensoriais transduzir estímulos nocivos causados por ambos os agentes endógenos e ambientais térmica, mecânica, química, e. Os corpos celulares destes neurónios aferentes estão localizados dentro do gânglio sensorial. gânglios sensoriais que inervam um órgão específico ou porção do corpo. Por exemplo, o gânglio da raiz dorsal (DRG) são localizados na coluna vertebral e extensão dos processos ao longo do corpo e membros. O gânglio trigeminal estão localizados no crânio e inervam a face, e das vias aéreas superiores. aferentes vagais dos gânglios nodosos se estender por todo o intestino, coração e pulmões. Os neurónios nodosos controlar um conjunto diversificado de funções, tais como: freqüência respiratória, irritação das vias aéreas, e reflexo de tosse. Assim, entender e manipular a sua função, é crítica para identificar e isolar sub-populações neuronais específicas das vias aéreas. No rato, as vias aéreas estão expostas a um corante marcador fluorescente, azul rápido, para rastreamento retrógrado de neurônio nodose específica das vias aéreass. Os gânglios nodosos são dissociados e de células activadas por fluorescência (FAC) de classificação é usado para coletar células positivas de corante. Em seguida, o ácido ribonucleico, de alta qualidade (ARN) é extraído a partir de células positivas de corante para a próxima geração de sequenciação. Usando este método de expressão do gene de vias aéreas neuronal específica é determinada.
Introduction
nervos Somatosensoriais transduzir estímulos nocivos causados por ambos os agentes endógenos e ambientais térmica, mecânica, química, e. Os corpos celulares destes nervos aferentes estão localizados em gânglios sensoriais, tais como a raiz dorsal, trigeminal, ou gânglios nodosos. Cada gânglio sensorial inerva regiões específicas do corpo e contém células que inervam órgãos e tecidos separadas dentro dessa região. Por exemplo, os gânglios da raiz dorsal (DRG) são localizados na coluna vertebral e extensão dos processos ao longo do corpo e membros, enquanto que o gânglio trigeminal estão localizados no crânio, contendo neurónios que inervam a face, olhos, meninges ou das vias aéreas superiores 1, 2. A gânglios nodosos do nervo vago está localizado no gargalo abaixo do crânio e contém corpos celulares que se estendem fibras nervosas ao longo do tracto gastrointestinal, no coração e pulmões e vias aéreas inferiores 3. Nos seres humanos o gânglio nodoso está sozinho, no entanto, no ratinho é fundidacom o gânglio jugular, que também inerva os pulmões 4. Este gânglio fundido é muitas vezes chamado a jugular / nodose complexa, gânglio vagal, ou simplesmente nodose gânglio 5. Aqui, é referido como o gânglio nodoso.
fibras aferentes do nodosos passar informações de vísceras para o núcleo do tracto solitário (NTS) no tronco cerebral. Entrada sensorial para esta gânglio único controla um conjunto diversificado de funções, tais como a motilidade intestinal 6, 7 da frequência cardíaca, a respiração 8,9, e as respostas respiratórias activado-irritantes 10,11. Com esta diversidade de funções e órgãos inervados, é crítico para alvejar e isolar subpopulações específicas de órgãos do gânglio nodoso, a fim de estudar vias neuronais individuais. No entanto, dado o pequeno tamanho do nodosos e ao limitado número de neurónios que contém esta não é uma tarefa trivial. Cada rato nodose gânglio contém cerca de 5.000 neurônios 12em adição a uma grande população de células de suporte satélite. Dos 5.000 neurónios nodosos, apenas 3 – 5% inervam as vias aéreas. Portanto, quaisquer alterações funcionais, morfológicos ou moleculares dentro dos neurônios das vias aéreas-inervação, devido a estimulação respiratória ou patologias, serão perdidos no gânglio nodoso densamente.
Para resolver este problema, foi desenvolvido um método para identificar e isolar neurónios que inervam as vias aéreas. As vias aéreas foram expostos a um corante marcador fluorescente para identificar os neurónios nodosos inervação subsequentes. Azul rápida foi apanhada por neurônios e viaja rapidamente para seus corpos celulares, onde é retido por até oito semanas 13 – 15. Uma vez identificados, um protocolo de dissociação suave, mas eficiente foi usado para preservar rotulagem corante e viabilidade celular para celular ativado fluorescente (FAC) de classificação. As células seleccionadas são usadas para extrair o ácido ribonucleico de alta qualidade (ARN) para determinar a expressão do gene ou fou outra análise molecular a jusante. Este protocolo proporciona uma técnica útil e robusto para isolar neurónios sensoriais que inervam um tecido de interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método para alvejar neurónios das vias aéreas-inervação nos gânglios nodosos do nervo vago. Uma vez marcado, os gânglios são suavemente dissociados para otimizar a preservar o número de células e viabilidade. Estes neurónios são, então, classificados FAC directamente em tampão de lise e o ARN é extraído. A importância deste protocolo é a capacidade de segmentar, isolar e preservar a qualidade de uma população de células sensorial específica. A expressão de genes é descr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiado pelo NIH conceder R01HL105635 a SEJ. Os autores gostariam de agradecer a Diego V. Bohórquez para aconselhamento técnico. Agradecemos também R. Ian Cumming para a assistência técnica e realização da citometria de fluxo no Centro de Duke vacina humana Instituto de Pesquisa Citometria de Fluxo de recursos partilhados (Durham, NC). A citometria de fluxo foi realizada no Laboratório de biocontenção Regional na Duke que recebeu o apoio parcial para a construção dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (UC6-AI058607).
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
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