in vitro에서 만능 줄기 세포에서 심근 세포를 생성하면 기초 과학 및 임상 응용을 위해 많은 양의 in vitro 심장 조직에 접근할 수 있습니다. 이 프로토콜은 심방화 인자 Grem2를 사용하여 얻은 심근세포의 수를 증가시키고 심방 표현형을 가진 심근세포를 생성합니다.
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이 논문에서
요약
초록
다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포 집단을 생성하기위한 프로토콜이 개발되었지만, 이들은 일반적으로 혼합 된 세포 표현형을 얻었다. 특정 심근 세포 아형을 포함하는 연구를 추구에 관심 연구진은보다 감독 차별화 접근법을 필요로한다. Grem2 생체 내 심방 실 형성에 필요한 분비 BMP 길항제와 마우스 배아 줄기 (ES) 세포를 처리하여, 심방 심장 세포 표현형 다수 생성 할 수있다. 설계 Myh6-을 DsRed-NUC 능성 줄기 세포주를 사용 식별, 선택 및 심근 정화용 수있다. 이 프로토콜에서 배아 체는 매달려 드롭 방법을 사용하여 Myh6-을 DsRed-NUC 세포에서 생성 및 분화 날 4 (D4)까지 정지 유지하고 있습니다. 셀 D4에 Grem2로 처리 젤라틴 코팅 된 플레이트 상에 도금. D8-D10 큰 계약 지역 문화에서 관찰 및 확장을 계속하고 m되는 사이D14을 통해 ature. 분자는 조직 학적 및 electrophysiogical 분석 Grem2 처리 한 세포에서 세포가 심방 심근의 생물학 및 다양한 약리 에이전트에 대한 반응을 연구하기 위해 체외 모델을 제공 심방과 같은 특성을 획득 나타냅니다.
서론
다 능성 줄기 세포를 생성하고, 특히 인간 1-5에서는 기초 연구 및 비 임상 연구에 대한 액세스 조직에 어려운 호스트로부터 세포를 연구하기위한 강력한 도구이다. 발달 신호 경로를 적절히 조절하여 원하는 표현형 운명 다 능성 줄기 세포의 분화를 유도 할 수있다. 대부분의 프로토콜은 다 능성 줄기 세포로부터 심근 6-14 (CMS)를 생성하기 위해 개발되었다. 이러한 프로토콜은 일반적으로 TFGβ 수퍼 패밀리 (티빈, BMP, 및 TGFβ)과의 Wnt 외생 적 성장 인자 및 / 또는 작은 분자 10,12-15의 시간 제한 추가를 통해 경로의 변조를 포함한다. 이러한 프로토콜은 CMS에가 세포의 비율을 증가 시키는데 일반적으로 효과적이지만, 심방, 심실 및 노드 / 전도 시스템의 계통을 나타내는 세포의 혼합 집단을 생성 특이성이 부족하다. 특정 심장을 연구하기 위해 더 많은 지시 차별화 아프로을 아류ACH가 필요합니다.
Gremlin2 (단 짧은에 대한 켈베로스 또는 PRDC 관련 Grem2라고도 단백질) 제브라 피쉬 (16)의 심장 개발하는 동안 적절한 심장 차별화와 심방 실 형성에 필요한 분비 BMP 길항제이다. 단지 중배엽 마커 T-Brachyury 1 등....
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프로토콜
세포 배양 미디어, 솔루션 및 시약 1. 준비.
- 마우스 배아 줄기 세포를 500 ㎖ (MESC) 혼합 및 살균 여과 (0.2 ㎛의 공극 크기) 445 ml의 글래스 최소 필수 중간 (GMEM), 50 ㎖의 열 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS)에 의해 용지를 준비 5 ㎖ 100X는 L- 집중 ml의 당 1 × 10 7 단위 및 1.43 μL의 ß-머 캅토 에탄올 (최종 농도가 50 μM입니다)에서 글루타민 교체, 5 ㎕를 재조합 마우스 백혈병 억제 인자 (LIF). 사용할 준비가 될 때까지 4 ℃에서 보관하십시오.
- 혼합 및 무균 여과하여 391 ml의 배아 바디 (EB) 분화 배지 500 ml를 준비 Iscove 개변 둘 베코 중간 (IMDM), FBS를 비활성화 100㎖의 열, 5 ㎖ (100X)가 L 글루타민 교체 농축 5 ㎖ 100X 비 필수 아미노산을 농축하여 (NEAA), 및 2.86 μl를 ß-머 캅토 에탄올 (최종 농도 100 μM)입니다. 준비가 될 때까지 4˚ C에서 보관 사용하기.
- w 0.2 % 준비여과하고 500 mL를 1g 돼지 피부 젤라틴 분말을 혼합하여 젤라틴 / V 수용액, 증류수 H 2 O. 고압 증기 멸균에 의해 소독. 젤라틴은 실온에서 물에 완전히 용해되지 않을 수....
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결과
이전 차별화, 만능 줄기 세포는 컴팩트하고 자발적인 분화 없어야합니다. 도 1a에 도시 된 셀은 단일화 및 프로토콜의 섹션 5.1에 기술 된 바와 같이 드랍 매달려에 사용될 준비가되었다. 도 1b에 도시 된 세포는 자발적으로 분화되고 매달려 상품의 제조에 사용되어서는 안된다.
패널은 2는 성공적으로 형성 사채 차별화 하루 2. 품질 사채에 그림에 포함 된 일반적으로. 그림 2와 같이 가장 내에서 균등하게 잘 둥근 매달려 방울 형성 분화 2 일까지, 사채는 구형 배열로 육안으로 볼 수 있어야합니다 매달려 방울 (그림 2)의 끝에서 줄기 세포를 분화. 프로토콜 섹션 5.3에 설명 된대.......
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토론
이 프로토콜은 정기적으로 심방 혈통의 특징의 CM의 높은 비율과 문화를 생산하고 있습니다. 모든 분화 프로토콜로서, 분화 이전 mESCs의 품질에 특별한주의를 기울여야한다. mESCs 정기적으로 적절한 형태 (그림 1A)에 대해 모니터링해야한다. 이전에 사채의 형성 발생 된 자연 분화는 심각 cardiogenesis의 효율성을 제한합니다 (그림 1B)를 계대 전에 제거해야합니다. EB의 크기도 cardiogenesis에 영향을 미칩니다. (200) 및 EB 1,000 사이의 시작 세포 수는 테스트 한과 EB 500 세포는 정기적으로 CM이 가장 높은 번호를 생성합니다. 전날 EB 형성에 계대되는 세포는 또한보다 효율적으로 구분하는 경향이있다.
"매달려 드롭"방법은이 프로토콜 25 EBS을 (를) 생성하는 데 사용됩니다. 심장 차별화 헥타르에 사용 사채를 만들기위한 다른 방법적이는.......
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공개 사항
이 원고의 저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH 보조금 HL083958 및 HL100398 (AKH)와 2T32HL007411-33에 의해 지원되었다 "심장 혈관 메커니즘의 프로그램 : 조사에서 훈련을"(JB)를.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-메르캅토에탄올 | 시그마 | M3148 | |
| IMDM | 시그마 | I3390 | |
| 비필수 아미노산 | Sigma | M7145 | |
| 10 cm 조직 배양 플레이트 | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm 세균 페트리 접시 | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm 세균 페트리 접시 | VWR | 25384-092 | |
| 6-웰 조직 배양 플레이트 | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 재조합 단백질 | R& 앰프; D Systems | 2069-PR-050 | |
| 멸균 필터 유닛 | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| 젤라틴 (돼지 껍질에서) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, 멸균 | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% 트립신-EDTA 솔루션 | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | Life Technologies | 14200 |
참고문헌
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from....
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재인쇄 및 허가
