Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.
Sklera är en tät bindväv som täcker och skyddar ögat. Den består huvudsakligen av täta kollagenknippen (typ I, III, IV, V, VI och VII). På grund av dess autofluorescens, opacitet, och tjocklek, har det inte befunnits lämplig för konfokalmikroskopi. Ett alternativt tillvägagångssätt till det som presenteras här, som använder formalinfixerade sklera inbäddad i paraffin för immunohistokemi, har tekniska utmaningar, speciellt när förvärmning av vävnad för antigenåtervinning. Eftersom sklera är relativt dålig i båda cellerna och fartyg, var användningen av större vävnadsprover undersökas för att hjälpa till att förhindra utsikt celler och för att förstå deras lokalisering i förhållande till fartyg och andra anatomiska ställen. För att möjliggöra för analys av större vävnadsprover under konfokalmikroskop, var en lamineringsteknik utförs för att skapa tunna skikt från sklera. Efter analys av resultaten av CD31 blodkärl och lymfkärl endothelial hyaluRonan receptor 1 (LYVE1) positiva celler, för vilka godkännande för vetenskaplig undersökning erhölls, fördelar och begränsningar av denna metod diskuteras.
Sklera är det styva yttre skiktet som täcker ögat, som är gjord av tät bindväv. Det bidrar till att skydda intraokulära strukturer och för att upprätthålla det intraokulära trycket. Således är sklera viktigt för tydlig vision. Det saknar lymfkärl 1,2 och därigenom bildar en yttre lymfatiska fritt gränsen mellan den och det lymfatiska fria inre öga 3-7. Det ger också fästställen för extraokulära muskler, och därigenom dela anatomiska likheter med senor. Eftersom sklera består huvudsakligen av täta knippen av kollagen typ I och har mindre antal kollagentyper III, IV, V, VI, VIII 8,9 och elastin 10,11, är denna vävnad inte lätt att använda för immunohistokemi.
Anatomiskt kan sklera separeras i tre huvudskikt: (1) den ytliga vaskulariserad episclera, som finns på undersidan av bindhinnan och Tenons kapsel och mot sidorna och the bakre delen av ögat mot omloppsbana; (2) den sklerala stroma, den huvudsakliga delen av sklera; och (3) lamina fusca, som är en tunn, pigmenterat skikt som ligger direkt ovanför uvea. Vår anatomiska kunskaper om sklera härrör huvudsakligen från första hälften av 20-talet. På den tiden, forskare studerat anatomi kärl främst genom att använda tusch injektioner 12 och vaskulär gjutning 13-15. Senare blev det forskat i angiografiska studier 16-19.
Sedan dess har äldre tekniker förbättrats och nya har utvecklats som har tillåtit oss att komplettera tidigare anatomiska kunskaper. Till exempel har det bara varit ungefär ett decennium sedan vi har haft sådana tillförlitliga lymfatiska markörer som lymfatiska kärlendotel specifik hyaluronan receptor-1 (LYVE1) 20 eller podoplanin 21. Konfokalmikroskopi erbjuder nya möjligheter för att studera de anatomiska egenskaperna hos olika tiFRÅGOR i ögat. Det gör det möjligt för flera fläckar som skall användas för att differentiera markörer för celler eller för att lokalisera celler i relation till blodkärlen och andra anatomiska strukturer. Den ger en översikt när provet är av en större storlek och ger oss möjlighet att skanna igenom ett prov när på jakt efter en specifik celltyp. Med Z-stack teknik kan konfokalmikroskopi användas för prover upp till 100-200 um. Sklera skiljer sig i tjocklek mellan 0,3 mm bakom muskelfästen och 1 mm vid den bakre stolpen 11. På grund av både sin tjocklek och opacitet, är sklera inte lämplig för konfokalmikroskopi med hjälp av traditionella metoder.
För att råda bot på detta har sklerala vävnader laminerade för att möjliggöra deras analys med konfokalmikroskopi. Denna teknik är användbar för att få en bättre förståelse för både fysiologiska och patologiska situationer i människo sklera.
Laminering av det humana sklera är en metod för utförande av konfokalmikroskopi på denna vävnad. Ett kritiskt steg i denna process är användningen av etanol i stället för formalin för att fästa vävnaden. Enligt vår erfarenhet, erhålles bättre resultat vid användning av etanol i stället för formalin för fixering. Trubbiga skalp förvärra det förfarande och bör undvikas. På liknande sätt bör uttorkningen av sklera undvikas, eftersom det komplicerar proceduren och minskar kvaliteten på bilderna. <…
The authors have nothing to disclose.
German Research Foundation (FOR2240 “(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye” to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 “Joining Forces to Corneal Regeneration” (to CC).
96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
26G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
15.5mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
Coverslips 24x24mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a |