باستخدام تقنية الترقق لتنفيذ متحد البؤر المجهري للالصلبة الإنسان
Summary
Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.
Abstract
الصلبة هي النسيج الضام الكثيفة التي تغطي وتحمي العين. وتتكون أساسا من حزم الكولاجين كثيفة (أنواع الأول والثالث والرابع، والخامس، والسادس، والسابع). نظرا لتألق ذاتي، الغموض، وسمك، لم يتم العثور يجعلها مناسبة للفحص المجهري متحد البؤر. نهج بديل لتلك المعروضة هنا، والذي يستخدم الصلبة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين لالمناعية، يواجه تحديات التقنية، وخصوصا عندما التسخين الأنسجة لاسترجاع مستضد. منذ الصلبة هي فقيرة نسبيا في كل من الخلايا والأوعية، واستكشاف واستخدام عينات الأنسجة أكبر للمساعدة على منع الخلايا تطل وفهم توطين بهم فيما يتعلق بالسفن ومواقع تشريحية أخرى. للسماح لتحليل عينات الأنسجة أكبر تحت المجهر متحد البؤر، تم تنفيذ أسلوب الترقق لخلق طبقات رقيقة من الصلبة. وبعد تحليل نتائج الأوعية الدموية CD31 والأوعية اللمفاوية البطانية hyaluرونان مستقبلات 1 (LYVE1) خلايا الإيجابية، التي تم الحصول على الموافقة للفحص العلمي، وتناقش مزايا وقيود من هذا الأسلوب.
Introduction
الصلبة هي الطبقة الخارجية الصلبة التي تغطي العين، وهو مصنوع من النسيج الضام الكثيفة. فهو يساعد على حماية الهياكل داخل العين والمحافظة على ضغط العين. وهكذا، فإن الصلبة أمر ضروري لرؤية واضحة. وهي خالية من الأوعية اللمفاوية 1،2 وبالتالي يشكل الحدود الخارجي خالية من اللمفاوية بينه وبين خالية من اللمفاوية العين الداخلية 3-7. كما يوفر مواقع المرفقات للعضلات العين، وبالتالي تقاسم التشابه التشريحية مع الأوتار. لأن الصلبة يتكون أساسا من حزم كثيفة من النوع الأول الكولاجين ولديه عدد أقل من أنواع الكولاجين الثالث، والرابع، والخامس، والسادس، والثامن 8،9 والإيلاستين 10،11، هذا النسيج ليست سهلة الاستخدام لالمناعية.
تشريحيا، الصلبة يمكن تقسيمها إلى ثلاث طبقات رئيسية: (1) ظاهر الصلبة أوعية دموية سطحية، وجدت تحت الملتحمة وكبسولة لسان ونحو الجانبين والعشرينالبريد مؤخرة العين التي تواجه المدار؛ (2) سدى الصلبة، والجزء الرئيسي من الصلبة. و (3) الغبساء الصفيحة، وهي طبقة رقيقة المصطبغة تقع مباشرة فوق العنبية. معرفتنا التشريحية حول الصلبة تنبع أساسا من النصف الأول من القرن التاسع 20. في ذلك الوقت، ودرس الباحثون تشريح الأوعية الدموية بشكل رئيسي باستخدام الهند حقن الحبر 12 والأوعية الدموية الصب 13-15. وفي وقت لاحق، وقد بحثت في دراسات التصوير الوعائي 16-19.
منذ ذلك الوقت، وقد تحسنت تقنيات قديمة، وقد تم تطوير تلك الجديدة التي سمحت لنا لتكملة المعرفة التشريحية السابقة. على سبيل المثال، فقد كان فقط حوالي عقد من الزمان منذ أن كان لهذه علامات اللمفاوية موثوق بها اللمفاوية بطانة الأوعية الدموية محدد حمض الهيالورونيك مستقبلات 1 (LYVE1) 20 أو podoplanin 21. يقدم المجهر متحد البؤر إمكانيات جديدة لدراسة الخصائص التشريحية لمنظمة الشفافية الدولية المختلفةssues من العين. انها تسمح للبقع متعددة لاستخدامها للتمييز علامات من الخلايا أو لتوطين الخلايا في ما يتعلق الأوعية الدموية والهياكل التشريحية الأخرى. ويقدم لمحة عامة عندما تكون العينة ذات حجم أكبر وتتيح لنا من خلال مسح عينة عندما بحثا عن نوع خلية معينة. مع تكنولوجيا Z-ستاك، الفحص المجهري متحد البؤر يمكن استخدامها لعينات تصل إلى 100-200 ميكرون. تختلف الصلبة في سمك بين 0.3 ملم وراء الإدراج العضلات و 1 مم في القطب الخلفي 11. على حد سواء بسبب سماكة، والغموض، والصلبة ليست مناسبة للفحص المجهري متحد البؤر باستخدام الطرق التقليدية.
لتصحيح هذا، كانت مغلفة الأنسجة الصلبة للسماح للتحليل مع المجهر متحد البؤر. هذه التقنية مفيدة لاكتساب فهم أفضل الحالات الفسيولوجية والمرضية في كل من الصلبة الإنسان.
Protocol
Representative Results
Discussion
تغليف الصلبة الإنسان هو وسيلة لأداء متحد البؤر المجهر على هذا النسيج. خطوة حاسمة في هذه العملية هو استخدام الإيثانول بدلا من الفورمالين للصق الأنسجة. في تجربتنا، ويتم الحصول على نتائج أفضل عند استخدام الإيثانول بدلا من الفورمالين لتثبيت. المشارط حادة تفاقم الإجراء ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
German Research Foundation (FOR2240 “(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye” to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 “Joining Forces to Corneal Regeneration” (to CC).
Materials
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24x24mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a | |
References
- Schlereth, S. L., et al. Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).
- Schlereth, S. L., et al. Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera. Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).
- Hos, D., Cursiefen, C. Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).
- Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- Streilein, J. W. Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments. Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).
- Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen. J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).
- Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts. Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).
- Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. Characterization of collagen from normal human sclera. Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).
- Lee, R. E., Davison, P. F. Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit. Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).
- Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).
- Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. . The sclera. , (2012).
- Kiss, F. Der Blutkreislauf des Auges. Ophthalmologica. 106, 225 (1943).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).
- Ashton, N., Smith, R. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm’s canal. Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).
- Hayreh, S. S., Scott, W. E. Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti. Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).
- Virdi, P. S., Hayreh, S. S. Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study. Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).
- Bron, A. J., Easty, D. L. Fluorescein angiography of the globe and anterior segment. Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).
- Ikegami, M. Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author’s transl). Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
