En utilisant une technique de plastification pour effectuer la microscopie confocale de la sclérotique humaine

Summary

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

Abstract

La sclérotique est un tissu conjonctif dense qui recouvre et protège l'œil. Il se compose principalement de faisceaux de collagène denses (types I, III, IV, V, VI et VII). En raison de sa autofluorescence, l'opacité et l'épaisseur, il n'a pas été jugé approprié pour la microscopie confocale. Une approche alternative à celle présentée ici, qui utilise sclérotique fixés au formol noyé dans de la paraffine pour l'immunohistochimie, présente des difficultés techniques, surtout lorsque le préchauffage du tissu pour l'extraction de l'antigène. Depuis la sclérotique est relativement pauvre dans les deux cellules et les vaisseaux, l'utilisation d'échantillons de tissus plus grands a été explorée pour aider à prévenir les cellules donnant et de comprendre leur localisation par rapport aux navires et d'autres sites anatomiques. Afin de permettre l'analyse d'échantillons de tissus plus importantes au microscope confocal, une technique de stratification a été réalisée pour créer des couches minces à partir de la sclérotique. Suite à l'analyse des résultats des CD31 vaisseaux sanguins et vaisseaux lymphatiques endothéliale hyalurécepteur ronan 1 (LYVE1) cellules positives, dont l'approbation pour examen scientifique a été obtenu, les avantages et les limites de cette méthode sont discutées.

Introduction

La sclérotique est la couche externe rigide qui recouvre l'œil, qui est composé de tissu conjonctif dense. Elle aide à protéger les structures intraoculaires et de maintenir la pression intraoculaire. Ainsi, la sclérotique est essentiel pour une vision claire. Elle est dépourvue de vaisseaux lymphatiques ^1,2 et forme ainsi une frontière extérieure libre-lymphatique entre elle et l'œil intérieur libre-lymphatique ^3-7. Il fournit également des sites de fixation pour les muscles extraoculaires, partageant ainsi des similitudes anatomiques avec des tendons. Étant donné que la sclérotique est constitué principalement de faisceaux denses de collagène de type I et dispose d'un plus petit nombre de types de collagène III, IV, V, VI, VIII et ^8,9 élastine ^10,11, ce tissu ne sont pas faciles à utiliser pour l' immunohistochimie.

Anatomiquement, la sclérotique peut être séparé en trois couches principales: (1) la épisclère vascularisé superficielle, qui se trouvent au-dessous de la conjonctive et de la capsule de Tenon et vers les côtés et ee arrière de l'œil face à l'orbite; (2) le stroma scléral, la majeure partie de la sclérotique; et (3) l'fusca lamina, qui est une mince couche pigmentée située directement au-dessus du uvée. Notre connaissance de l' anatomie de la sclérotique provient principalement de la première moitié du 20 ^e siècle. A cette époque, les chercheurs ont étudié l'anatomie de la vascularisation principalement en utilisant l'encre de Chine injections ¹² et vasculaires coulée ^13-15. Plus tard, il a été étudié dans des études angiographiques ^16-19.

Depuis ce temps, les techniques anciennes ont été améliorées et de nouveaux ont été développés qui nous ont permis de compléter les connaissances anatomiques précédent. Par exemple, il a été seulement environ une dizaine d' années depuis que nous avons eu de tels marqueurs lymphatiques fiables que l' endothélium vasculaire lymphatique hyaluronane spécifique du récepteur-1 (LYVE1) ²⁰ ou podoplanin ^21. La microscopie confocale offre de nouvelles possibilités pour l'étude des caractéristiques anatomiques des différents tiquest de l'œil. Il permet de multiples tâches à être utilisées pour différencier les marqueurs de cellules ou pour la localisation des cellules par rapport aux vaisseaux sanguins et d'autres structures anatomiques. Il donne un aperçu lorsque l'échantillon est d'une taille plus grande et nous permet de numériser à travers un échantillon lorsque la recherche d'un type de cellule spécifique. Avec la technologie Z-Stack, la microscopie confocale peut être utilisé pour des échantillons jusqu'à 100 à 200 um. La sclérotique diffère d'épaisseur comprise entre 0,3 mm derrière les insertions musculaires et 1 mm au niveau du pôle postérieur ^11. À la fois en raison de son épaisseur et d'opacité, la sclère ne convient pas pour la microscopie confocale en utilisant des méthodes traditionnelles.

Pour remédier à cela, les tissus scléral ont été stratifiées pour permettre leur analyse par microscopie confocale. Cette technologie est utile pour une meilleure compréhension des deux situations physiologiques et pathologiques dans la sclérotique humaine.

Protocol

L'utilisation de tissus humains doit être examiné et approuvé par un comité d'examen institutionnel ou l'équivalent. Le travail décrit ici a été approuvé par le comité d'éthique local et a eu l'approbation de l'examen scientifique. Ce travail a été effectué conformément à la Déclaration d'Helsinki. Les spécimens scléral humains ont été obtenus à partir des yeux des donneurs de globe (post-mortem durée maximale de 24 heures) à la Banque des yeux du Département d'Ophtalmologie, Universi…

Representative Results

Dans les expériences représentatives effectuées ici, il y a des avantages démontrables découlant de l'utilisation de cette technique de stratification particulière. La première expérience illustre le réseau diversifié de la épiscléral plexus vaisseau sanguin dans trois images représentatives (figure 3). Les vaisseaux sont positifs pour CD31. La deuxième expérience montre des cellules immunit…

Discussion

Stratifier la sclérotique humaine est un procédé pour effectuer la microscopie confocale sur ce tissu. Une étape critique dans ce procédé est l'utilisation de l'éthanol au lieu de la formaline pour fixer le tissu. Dans notre expérience, de meilleurs résultats sont obtenus lors de l'utilisation de l'éthanol au lieu de la formaline pour la fixation. scalpels Blunt aggravent la procédure et doivent être évités. De même, l'assèchement de la sclérotique doit être évitée, car elle compl…

Materials

96% ethanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Germany	P075.4
binocular stereo microscope	Motic, Hongkong, China	n.a
26G needles	Terumo, Leuven, Belgium	303800
15.5mm trepan	Geuder, Heidelberg, Germany	n.a
no.10 scalpel	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	2E+08
ophthalmic scalpel micro feather	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	no. 7657BR
CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)	Dako, USA	IR610
LYVE1 antibody  (polyclonal rabbit anti human)	Zytomed, Germany	RBK014-05
goat anti mouse FITC antibody	Sigma Aldrich, Steinheim, Germany	F0257
goat anti rabbit Cy3 antibody	Dianova, Germany	111-165-003
Goat Serum normal	Dako, Glostrup, Denmark	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335.1
microscope slides	Engelbrecht, Edermünde, Germany	WC7695002
Coverslips 24x24mm	Th. Gayer, Lohmar, Germany	7695026
DAKO fluorescent mounting medium	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510 confocal microscopy	Carl Zeiss AG, Jena, Germany	n.a