Usando uma técnica de estratificação para executar microscopia confocal da esclera humana
Summary
Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.
Abstract
A esclerótica é um tecido conjuntivo denso que cobre e protege o olho. Ela consiste principalmente de feixes de colágeno densas (tipos I, III, IV, V, VI e VII). Devido à sua autofluorescência, opacidade, e espessura, não foi considerado adequado para a microscopia confocal. Uma abordagem alternativa para o apresentado aqui, que utiliza esclera fixado com formalina embebido em parafina para imuno-histoquímica, tem desafios técnicos, especialmente quando o pré-aquecimento do tecido para a recuperação de antigénio. Desde a esclera é relativamente pobre em ambas as células e vasos, o uso de amostras de tecido maiores foi explorada para ajudar a evitar que as células com vista e para compreender a sua localização em relação aos navios e outros sítios anatômicos. Para permitir a análise de amostras de tecido maiores, sob o microscópio confocal, uma técnica de laminação foi efectuada para criar camadas finas da esclera. Após a análise dos resultados dos vasos sanguíneos CD31 e vasos linfáticos endotelial hyalureceptor Ronan 1 (LYVE1) células positivas, para o qual foi obtido uma autorização para exame científico, as vantagens e limitações deste método são discutidas.
Introduction
A esclerótica é a camada externa rígida que cobre o olho, o que é feito de tecido conjuntivo denso. Isso ajuda a proteger as estruturas intra-oculares e para manter a pressão intra-ocular. Assim, a esclerótica é essencial para a visão clara. É desprovida de vasos linfáticos 1,2 e, assim, forma uma borda livre-linfática exterior entre ele e o olho interior livre de linfático 3-7. Ele também fornece locais de ligação para os músculos extra-oculares, partilhando assim semelhanças anatômicas com tendões. Porque a esclera consiste principalmente de feixes densos de colágeno tipo I e tem um número menor de colágeno tipo III, IV, V, VI, VIII 8,9 e elastina 10,11, este tecido não é fácil de usar para imuno-histoquímica.
Anatomicamente, a esclerótica podem ser separadas em três camadas principais: (1) o episclera vascularizado superficial, localizado por debaixo da conjuntiva e da cápsula de Tenon e para os lados e the parte de trás do olho de frente para a órbita; (2) o estroma escleral, a parte principal da esclera; e (3) o fusca lâmina, que é uma camada fina, pigmentada localizada directamente acima da úvea. Nosso conhecimento anatômico sobre a esclera decorre, principalmente, da primeira metade do século 20. Naquela época, os investigadores estudaram a anatomia da vasculatura principalmente usando Índia injeções de tinta 12 e vascular lançando 13-15. Mais tarde, foi pesquisado em estudos angiográficos 16-19.
Desde então, técnicas mais antigas foram melhoradas e novos foram desenvolvidos que nos permitiram completar conhecimento anatômico anterior. Por exemplo, tem sido apenas cerca de uma década desde que nós tivemos tais marcadores linfáticos confiáveis como endotélio vascular linfática hyaluronan específica receptor-1 (LYVE1) 20 ou podoplanina 21. A microscopia confocal oferece novas possibilidades para o estudo das características anatômicas dos diferentes tissues do olho. Ele permite várias manchas a ser utilizada para diferenciar os marcadores de células ou para a localização das células em relação aos vasos sanguíneos e outras estruturas anatómicas. Ele fornece uma visão geral, quando a amostra é de um tamanho maior e permite-nos verificar através de uma amostra, quando em busca de um tipo de célula específico. Com a tecnologia Z-Pilha, microscopia confocal pode ser utilizado para as amostras até 100-200 um. A esclerótica difere de espessura entre 0,3 mm por trás das inserções musculares e 1 mm no pólo posterior 11. Devido tanto a sua espessura e opacidade, a esclera não é adequado para microscopia confocal utilizando métodos tradicionais.
Para remediar esta situação, tecidos esclerais foram estratificados para permitir a sua análise com microscopia confocal. Esta tecnologia é útil para obter uma melhor compreensão de ambas as situações fisiológicas e patológicas na esclera humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Laminar a esclerótica humana é um método para a realização de microscopia confocal sobre este tecido. Um passo essencial neste processo é a utilização de etanol em vez de formalina para a aposição do tecido. Em nossa experiência, os melhores resultados são obtidos quando se utiliza etanol em vez de formol para fixação. bisturis Blunt agravar o processo e devem ser evitadas. Da mesma forma, a secagem da esclera deve ser evitado, uma vez que complica o processo e reduz a qualidade das imagens.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
German Research Foundation (FOR2240 “(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye” to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 “Joining Forces to Corneal Regeneration” (to CC).
Materials
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24x24mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a | |
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