MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.
בידול מסוף שרירי שלד מתחיל עם המחויבות של תאי מבשר mesodermal פלוריפוטנטיים כדי myoblasts. תאים אלה עדיין את היכולת להתרבות או שהם יכולים להבדיל הפתיל לתוך myotubes multinucleated, אשר לְהַבשִׁיל נוספת ליצירת myofibers. בידול מסוף שריר השלד בניצוחו של פעולה מתואמת של גורמי שעתוק שונים, בפרט חברי גורמים רגולטוריים שרירים או MRFs (Myod, Myogenin, Myf5, ו MRF4), המכונה גם משפחת גורמי שעתוק bHLH myogenic. גורמים אלה לשתף פעולה עם מתחמי שיפוץ-הכרומטין בתוך רשת רגולצית תעתיק משוכללת להשיג myogenesis שלד. לפי גישה זו, Myod נחשבת גורם שעתוק מאסטר myogenic המעוררים בידול מסוף שריר. רעיון זה מתחזק לנוכח היכולת של Myod להמיר תאים שאינם שרירים לתאי שריר שלד. כאן אנו מתארים גישה המשמשת לזיהוי Myodשותפי חלבון באופן ממצה על מנת להבהיר את הגורמים השונים המעורבים בידול מסוף שרירי שלד. המטרה לטווח הארוכה היא להבין את המנגנונים אפיגנטיים מעורבים בויסות גני שרירי שלד, כלומר., מטרות Myod. שותפי Myod מזוהים באמצעות טיהור טנדם זיקה (תג TAP) ממערכת Heterologous מצמידה ספקטרומטריית מסה (MS) אפיון, ואחריו אימות של תפקיד שותפים רלוונטיים במהלך בידול מסוף שרירי שלד. צורות Aberrant גורם myogenic, או התקנה הסוטה שלהם, קשורות עם מספר הפרעות שריר: מיאסטניה מולד, ניוון myotonic, ראדומיוסרקומה וליקויי התחדשות שריר. ככזה, גורמי myogenic לספק מאגר של מטרות טיפוליות פוטנציאליות בהפרעות שריר, הוא לעניין המכאניזם שיוצר מחלה עוצמה, מנגנון שיקום שיכול לשפר את הטיפול במחלה. לפיכך, להבין." המפורטדינג של האינטראקציות מולקולאריים ואת התוכניות הגנטיות בשליטת גורמי myogenic חיוני תכנון רציונל של טיפולים יעילים.
אורגניזמים רבים תאי איקריוטיים מורכבים של איברים ורקמות שונים. לכל רקמה תפקודית ביטוי דפוס גן ספציפי, אשר נקבע בכל שלב התמיינות. התמיינות תאים כרוכה הפעלה של גנים ספציפיים, תחזוקת הביטוי שלהם, בדרך כלל, השתקה של סט של גנים כאלה המעורבים התפשטות תאים. בידול שרירי השלד, או myogenesis, הוא אפוא תהליך רב שלבי, המתחיל קביעת תאי גזע mesodermal לתוך myoblasts, ולאחר מכן מוביל בידול הטרמינל של myoblasts אלה לתוך מונו בעלי הגרעין הראשון, ולאחר מכן רב-גרעיני, myotubes . לפיכך, myoblasts הוא "נקבע" תאים, כי הם עדיין מסוגלים להתרבות, אבל הם מחויבים שושלת שרירי השלד, ובכך יכולים להבחין אך ורק לתאי שריר שלד גם במהלך התפתחות עוברית או התחדשות שריר מבוגרת. תהליך מסוף שרירי שלד שונהentiation הוא מתוזמר על ידי תוכנה גנטית מיוחדת שמתחילה ביציאת צמיתת מחזור התא של תאי מבשר myoblast שמוביל השתקה מוחלטת של גנים הקשורים התפשטות, כגון גני מטרת E2F 1. ואכן, במהלך התהליך של בידול הטרמינל, מעצר התפשטות myoblast הוא צעד חיוני שמקדים את הביטוי של גנים ספציפיים שריר שלד ואת ההיתוך של myoblasts לתוך myotubes 2. תכנית כזו מאפשרת תאי גזע שריר בוגרים, המכונים גם תאי לווין, להבדיל במהלך תהליך ההתחדשות בעקבות פציעה בשרירי שלד.
Myogenesis יונקים תלויה באופן מכריע משפחה של לולאה בצורת סליל סליל בסיסית myogenic (bHLH) שעתוק גורמי Myod, Myf5, MRF4 ו Myogenin, מכונה לעתים קרובות כמו המשפחה של גורמים נחישות שרירי השלד או MRFs (גורמי תקינה שרירים) 3. כל אחד מהם ממלא תפקיד חיוני במפרט ו DIFferentiation של תאי שריר שלד ושיש לו דפוס ביטוי ספציפי 4 5-7. הפעלת Myf5 ו Myod מהווה את הצעד הקובע כי מתחייב לתאי שושלת myogenic, והביטוי הבא של Myogenin מפעיל myogenesis עם הפעלה של גנים ספציפיים שריר שלד, כגון MCK (שרירים קריאטין קינאז). גורמי שעתוק bHLH myogenic פעולה עם בני משפחת MEF2 בהפעלת גנים שריר מ לוקוסים שותק בעבר 8. הם גם מגרים שעתוק הגנים שרירי השלד כמו heterodimers עם חלבונים bHLH בכל מקום, E12 ו E47, המכונה חלבונים E, המחייבים כביכול E-תיבות 8 גנים רגולטוריים שונים אזורים. טוויסט, זיהוי (מעכב של בידול) וגורמים נוספים שלילי לווסת את התהליך הזה, על ידי מתחרה עם Myod עבור חלבוני E מחייבים 8.
Myod נחשב לשחקן המרכזי מפעילת בידול מסוף שרירים 9 </sעד> מאז יש לו את היכולת להשפיע על קביעת myogenic / בידול (טרנס-דיפרנציאציה) תכנית ברבים באופן מלא מערכות בדיל הלא שריר 10-13. אכן, ביטוי כפוי של Myod ומשרה את בידול טרנס מסוגים סלולריים שונים גם אלה נגזרו אחר ממוצא embryologic 12. לדוגמה, Myod יכול להמיר hepatocytes, פיברובלסטים, מלנוציטים, neuroblasts, ו adipocytes לתאים דמויי שריר. הפעולה חוצה בהתפלגותו של Myod כרוכה הפעלה תקינה של התכנית הגנטית myogenic (גני המטרה שלה בעיקר) בסביבה לא-שרירי, במקביל כדי השתקת התכנית הגנטית המקורית (בעיקר, גני התפשטות).
בשנת מתרבים myoblasts, Myod מתבטאת אך אינו מסוגל להפעיל גנים היעד שלה גם כאשר הוא נקשר היזמים שלהם 14-16. לכן, הדרישה Myod להתבטא ברציפות myoblasts מובחן נשאר elu למדיsive. Myod יכול להדחיק גני ליעדו בשל הגיוס של אנזימי שינוי-הכרומטין דיכוי ב מתרבה myoblasts לפני הטעינה של הפעלת שיפוץ הכרומטין אנזימי 14,17. לדוגמה, ב מתרבים myoblasts, Myod קשורה תעתיק שיתוף מדכא KAP-1, deacetylases היסטון (HDACs) ו methyltransferases ליזין הדיכוי (KMTs), כולל היסטון H3 ליזין 9 או H3K9 ו H3K27 KMTs, פעיל לדכא ביטוי גנים היעד שלה על ידי הקמת 14,17 מבנה הכרומטין מקומית דיכוי. חשוב לציין כי הדו"ח האחרון עולה כי Myod הוא עצמו מפוגל ישירות על ידי H3K9 KMT G9a וכתוצאה מכך עיכוב של transactivating שלה פעילות 16.
המנגנונים אפיגנטיים המעורבים טרנס-הבחנה זו של תאים שאינם שריר ידי Myod הם ידועים ברובם. יש לציין, שורות תאים בעלי עמידות בידול טרנס-induced Myod. לכן, תאי הלה, Myod הוא גם פעיל אואפילו יכול לתפקד כמו מדכא ולא activator של שעתוק בשל חוסר ביטוי של למקטע BAF60C של הכרומטין שיפוץ המורכב SWI / SNF 18. מודל זה ולכן יכול להיות בחירה לאפיין את המנגנונים טובים יותר של דיכוי גני מושרה Myod. זה מתאים גם כדי assay את היכולת של Myod לגרום סביבת הכרומטין דיכוי בבית לוקוסי היעד שלה עם השותפים הקשורים אליו ולכן לחשוף את מנגנוני הדיכוי תלוי Myod ב מתרבה myoblasts מכוונן בידול סופנית.
כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לזיהוי שותפי Myod באמצעות טיהור טנדם זיקה (תג TAP) מצמידה ספקטרומטריית מסה (MS) אפיון. השימוש בתאי הלה-S3 להביע ביציבות הדגל-HA-Myod רשאי לקבל מספיק חומר כדי לטהר את מתחמי Myod מתמציות גרעיניות מופרדות. זיהוי שותפי Myod במערכת Heterologous לווה validatiעל במערכת רלוונטית.
השיטה המוצגת מאפשרת זיהוי ממצה של שותפים של גורם שעתוק, Myod. הוא גילה שותפי Myod במערכת Heterologous עמידה בידול נגרם Myod, כלומר תאי הלה-S3. לפיכך, על פי הגדרתו, שותפי Myod מזוהים באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף. אלה כוללים גורמי שעתוק בכלל רצף ספציפי, אנזימי שינוי-הכרומטין, חלבוני עיב?…
The authors have nothing to disclose.
Work in the Ait-Si-Ali lab was supported by the Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot and the ”Who Am I?” Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071 funded by the French Government through its ”Investments for the Future” program operated by the ANR under grant #ANR-11-IDEX-0005-01. EB was supported by an INCa grant.
Cell lines | |||
HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Spinner | Corning | 778531 | |
Homogenizer : Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
SDS-polyacrylamide 4-12 % gel | Life technologies | NP0336BOX | |
4X loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
10X reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |