Identificatie van MyoD Interactoomanalyse gebruik van Tandem Affinity Purification Gekoppeld aan massaspectrometrie
Summary
MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.
Abstract
Skeletspieren terminale differentiatie begint met de inzet van pluripotente mesodermale voorlopercellen te myoblasten. Deze cellen nog steeds de proliferatie- of ze kunnen differentiëren en zekering in meerkernige myotubes, die verder rijpen om myovezels te vormen. Skeletspieren terminale differentiatie wordt georkestreerd door de gecoördineerde actie van de verschillende transcriptiefactoren, in het bijzonder de leden van de Muscle Regulatory Factors of MRFs (MyoD, myogenin, Myf5 en MRF4), ook wel de myogene bHLH transcriptiefactoren familie. Deze factoren werken samen met chromatine-remodeling complexen binnen uitgewerkte transcriptie regulerende netwerk om het skelet myogenesis bereiken. Hierbij wordt MyoD beschouwd als de meester myogene transcriptiefactor bij het ontstaan van de spieren terminale differentiatie. Deze opvatting wordt versterkt door het vermogen van MyoD niet-spiercellen zetten in skeletspiercellen. Hier beschrijven we een aanpak gebruikt om MyoD identificereneiwitpartners limitatief om de verschillende factoren die bij skeletspier differentiatie helderen. De lange-termijn doel is om de epigenetische mechanismen die betrokken zijn bij de regulatie van de skeletspieren genen, dwz., MyoD doelen begrijpen. MyoD partners worden aangegeven met Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) vanaf een heteroloog gekoppeld met massaspectrometrie (MS) karakterisering, gevolgd door validatie van de rol van de relevante partners in skeletspier terminale differentiatie. Afwijkende vormen van myogene factoren, of de afwijkende regelgeving, worden geassocieerd met een aantal van spieraandoeningen: aangeboren myasthenia, myotone dystrofie, rhabdomyosarcoom en gebreken in de spieren regeneratie. Als zodanig myogene factoren een pool van mogelijke therapeutische doelwitten in spieraandoeningen, zowel wat de mechanismen die ziekte zelf en regeneratieve mechanismen die ziektebehandeling kunnen verbeteren veroorzaken. Zo is de gedetailleerde understanding van de intermoleculaire interacties en genetische programma gecontroleerd door de myogene factoren essentieel voor een rationeel ontwerp van efficiënte therapieën.
Introduction
Eukaryote multicellulaire organismen zijn samengesteld uit verschillende organen en weefsels. Elke functionele weefsel heeft een specifiek gen-expressie patroon dat wordt bepaald bij elke differentiatiestap. Celdifferentiatie omvat activering van specifieke genen, onderhoud van hun expressie en algemeen zwijgen van een aantal genen, die betrokken zijn bij celproliferatie. Skeletspierdifferentiatie of myogenese, dus een meerstaps-proces, dat begint met het bepalen van mesodermale stamcellen in myoblasten en vervolgens leidt tot de differentiatie van deze myoblasten in eerste mono-kernhoudende en vervolgens meerdere kernen, myotubes . Zo myoblasten worden 'bepaald' cellen, die nog steeds in staat zijn te laten groeien, maar ze zijn toegewijd aan de skeletspieren afstamming, en kan dus alleen differentiëren in skeletspiercellen ofwel tijdens de embryonale ontwikkeling of bij volwassen spier regeneratie. Het proces van de skeletspieren terminal verschillenentiation wordt georkestreerd door een specifieke genetische programma dat begint met de permanente verlaten de celcyclus van myoblast precursorcellen die leidt tot een definitieve silencing van proliferatie geassocieerde genen, zoals E2F doelgenen 1. Inderdaad, tijdens het proces van terminale differentiatie, proliferatie van myoblasten arrestatie een cruciale stap die de expressie van specifieke genen skeletspier en fusie van myoblasten in myotubes 2 voorafgaat. Een dergelijk programma maakt spier stamcellen volwassen, ook wel satelliet-cellen, om te differentiëren tijdens het regeneratieproces volgende skeletspieren letsel.
Zoogdieren myogenesis is sterk afhankelijk van een familie van myogene basic helix-loop-helix (bHLH) transcriptiefactoren MyoD, Myf5, MRF4 en myogenin, vaak aangeduid als de familie van de skeletspieren bepaling factoren of MRFs (Muscle Regulatory Factors) 3. Elk van hen speelt een essentiële rol in de specificatie en differentiatie van de skeletspieren cellen en heeft een specifieke uitdrukking patroon 5-7 april. De activering van Myf5 en MyoD vormt de bepalende stap die cellen verbindt aan de myogene lineage, en daaropvolgende expressie van myogenin triggers myogenesis met activatie van skeletspieren specifieke genen, zoals MCK (Muscle Creatine Kinase). Myogene bHLH transcriptiefactoren samen met leden van de familie MEF2 in de activatie van spier- genen uit eerder stille loci 8. Ze stimuleren ook de skeletspier gentranscriptie als heterodimeren met alomtegenwoordige bHLH eiwitten, E12 en E47, bekend als E-eiwitten, die de zogenaamde E-dozen in diverse gen-regulatoire gebieden 8 te binden. Twist, Identiteitskaart (remmer van differentiatie) en andere factoren negatief regelen dit proces, door te concurreren met MyoD voor E eiwitten binden 8.
MyoD wordt beschouwd als de voornaamste speler in triggering spier terminale differentiatie 9 </sup> aangezien het het vermogen tot bepaling myogene / differentiatie (trans-differentiatie) programma in vele volledig gedifferentieerde non-spiersystemen 10-13 induceren. Inderdaad, gedwongen expressie van MyoD induceert de trans-differentiatie van verschillende celtypes zelfs die afgeleid van een ander embryonale oorsprong 12. Zo kan MyoD hepatocyten, fibroblasten, melanocyten, neuroblasten, en adipocyten zetten in spier-achtige cellen. De trans-differentiërende werking van MyoD omvat een abnormale activatie van het myogene genetische (met name de doelwitgenen) in een niet-musculaire omgeving, gelijktijdig aan de onderdrukking van de genetica`s (met name, proliferatie genen).
In prolifererende myoblasten, wordt MyoD uitgedrukt, maar is niet in staat om zijn doel genen te activeren, zelfs wanneer het zich bindt aan hun promotoren 14-16. Daarom is de eis MyoD continu worden uitgedrukt in niet-gedifferentieerde myoblasten steeds vrij elusive. MyoD kon zijn doel genen als gevolg van de aanwerving van repressieve chromatine modificerende enzymen onderdrukken in delende myoblasten vóór het laden van het activeren van chromatine remodeling enzymen 14,17. Bijvoorbeeld, in prolifererende myoblasten, MyoD is geassocieerd met transcriptionele co-repressor KAP-1, histondeacetylasen (HDACs) en repressieve lysine methyltransferasen (kmts), waaronder histon H3 lysine 9 of H3K9 en H3K27 kmts en actief onderdrukken de doelwitgenen expressie door de oprichting van een lokaal repressieve chromatinestructuur 14,17. Belangrijk is dat een recent rapport blijkt dat MyoD zelf direct gemethyleerd door de H3K9 KMT G9a wat resulteert in de remming van zijn transactiverende activiteit 16.
De epigenetische mechanismen betrokken bij de trans-differentiatie van niet-spiercellen door MyoD grotendeels onbekend. Met name sommige cellijnen resistent tegen MyoD geïnduceerde trans-differentiatie. Dus in HeLa-cellen, MyoD is inactief ofzelfs functioneren dan repressor plaats van transcriptie-activator door gebrek aan expressie van de BAF60C subeenheid van chromatine remodeling complex SWI / SNF 18. Dit model kan dus gekozen om beter te karakteriseren van de mechanismen van MyoD geïnduceerde genrepressie. Het is ook geschikt om het vermogen van MyoD repressieve chromatine milieu veroorzaken bij zijn doel loci met de daarbij behorende partners en dus ontdek de MyoD-afhankelijke repressieve mechanismen in delende myoblasten te fine-tunen terminale differentiatie testen.
Hier beschrijven we het protocol voor de identificatie van MyoD partners met behulp van Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) karakterisering. Het gebruik van HeLa-S3-cellen stabiel tot expressie Flag-HA-MyoD toegestaan voldoende materiaal naar de MyoD complexen van gefractioneerde kernextracten zuiveren. De identificatie van MyoD partners in het heterologe systeem volgde validatiop in een relevante systeem.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gepresenteerde methode maakt uitputtend identificatie van partners van een transcriptiefactor, MyoD. Geopenbaard MyoD partners in een heteroloog systeem resistent tegen MyoD geïnduceerde differentiatie, namelijk HeLa-S3-cellen. Dus per definitie, die MyoD partners zijn alomtegenwoordig uitgedrukt. Deze omvatten algemene en sequentie-specifieke transcriptiefactoren, chromatine-modificerende enzymen, RNA verwerking eiwitten, kinasen (tabellen 1 en 2). Omdat HeLa-S3-cellen zijn resiste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Ait-Si-Ali lab was supported by the Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot and the ”Who Am I?” Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071 funded by the French Government through its ”Investments for the Future” program operated by the ANR under grant #ANR-11-IDEX-0005-01. EB was supported by an INCa grant.
Materials
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer : Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12 % gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4X loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10X reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
- Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
- Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
- Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
- Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
- Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
- Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
- Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
- Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
- Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
- Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
- Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
- Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
- Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
- Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
- Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
- Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
- Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
- Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
- Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
- Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270 (2007).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
- Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
- Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
- Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858 (2014).
- Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
- Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
- Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
- Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
- Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it’s time to exchange!. Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
- Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
