Идентификация MyoD интерактомные Использование Тандем Аффинная очистка В сочетании с масс-спектрометрии
Summary
MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.
Abstract
Скелетная мышца терминальная дифференцировка начинается с обязательством плюрипотентных клеток-предшественников мезодермальными к миобластов. Эти клетки имеют еще способность пролиферировать или они могут дифференцироваться и запал в многоядерные мышечные трубки, которые нагноиться далее с образованием мышечные волокна. Скелетных мышц терминала дифференциация оркестрованы скоординированные действия различных факторов транскрипции, в частности, члены мышце регуляторных факторов или MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5 и Mrf4), которая также называется миогенная bHLH факторов транскрипции семейства. Эти факторы сотрудничают с хроматином ремоделирования комплексов в сложной транскрипционной регуляторной сети для достижения скелетной миогенез. В этом, MyoD считается мастером миогенная фактор транскрипции в инициировании мышцы терминальной дифференцировки. Это понятие усиливается благодаря способности MyoD конвертировать не-мышечные клетки в клетках скелетных мышц. Здесь мы опишем подход, используемый для идентификации MyoDпартнеров белка исчерпывающим образом для того, чтобы выяснить различные факторы, участвующие в скелетных мышц терминальной дифференцировки. Долгосрочная цель состоит в том, чтобы понять эпигенетические механизмы , участвующие в регуляции генов скелетных мышц, то есть., MyoD целей. партнеры MyoD идентифицированы с помощью Тандем аффинной очистки (TAP-Tag) с гетерологичным системы, связанной с масс-спектрометрии (МС) характеристики, а затем путем подтверждения роли соответствующих партнеров во время скелетных мышц терминальной дифференцировки. Аберрантных форм миогенных факторов, или их аномальным регулирования, связаны с целым рядом мышечных нарушений: врожденная миастения, миотонической дистрофии, рабдомиосаркома и дефектов в мышечной регенерации. Таким образом, миогенные факторы обеспечивают пул потенциальных терапевтических мишеней в мышечных расстройств, как с точки зрения механизмов, которые вызывают самой болезни и регенеративные механизмы, которые могут повысить эффективность лечения заболевания. Таким образом, детальное understanдинь межмолекулярных взаимодействий и генетических программ, контролируемых миогенных факторов имеет важное значение для рациональной разработки эффективных методов лечения.
Introduction
Эукариотические многоклеточные организмы состоят из различных органов и тканей. Каждая функциональная ткань имеет специфический экспрессии генов, которая определяется на каждом этапе дифференцировки. Клеточная дифференцировка включает в себя активацию специфических генов, поддержание их экспрессии и, как правило, глушителей из набора генов, таких лиц, участвующих в пролиферации клеток. Скелетная дифференцировки мышц, или миогенез, таким образом, является многоступенчатый процесс, который начинается с определения мезодермальных стволовых клеток в миобласты, а затем приводит к терминальной дифференцировки этих миобластов в первую моно-зарождаются, а затем мульти-зарождаются, мышечных трубочек , Таким образом, миобласты являются "определены" клетки, которые все еще способны размножаться, но они полны решимости скелетных мышц линии, и, следовательно, могут дифференцироваться только в клетках скелетных мышц либо во время эмбрионального развития или в регенерации взрослых мышц. Процесс скелетных мышц терминала отличаютсяentiation является оркестровка определенной генетической программой , которая начинается с постоянного выхода из клеточного цикла клеток – предшественников миобластов , что приводит к окончательному глушителей пролиферации генов , ассоциированных, таких как E2F генов – мишеней 1. Действительно, в процессе терминальной дифференцировки, арест пролиферации миобластов является важным шагом , который предшествует экспрессии скелетных мышц специфических генов и слияние миобластов в мышечные трубки 2. Такая программа позволяет взрослых мышечные стволовые клетки, также называемые сателлитные клетки, дифференцироваться во время процесса регенерации после поврежденными скелетными мышцами.
Млекопитающим миогенез критически зависит от семьи миогенного основной спираль-петля-спираль (bHLH) транскрипционные факторы MyoD, Myf5, Mrf4 и Myogenin, часто называют семейством скелетных мышц факторов определения или MRFs (мышцы регуляторные факторы) 3. Каждый из них играет существенную роль в спецификации и дифференциации скелетных мышечных клеток и имеет специфический характер экспрессии 4 5-7. Активация Myf5 и MyoD представляет собой определяющий шаг, обязывающее клетки к миогенной линии, и последующее выражение Myogenin вызывает миогенез с активацией скелетных мышц специфических генов, таких как ГХК (Muscle креатинкиназы). Миогенные bHLH факторы транскрипции сотрудничать с членами семьи Mef2 в активации генов мышечных от ранее немого локусов 8. Они также стимулируют скелетную транскрипцию гена мышечной как гетеродимеры с повсеместным bHLH белками, Е12 и Е47, известные как Е белки, которые связываются с так называемыми электронные ящики в различных генных регуляторных областей 8. Twist, Id (ингибитор дифференцировки) и других факторов , отрицательно регулируют этот процесс, конкурируя с MyoD для Е – связывающих белков 8.
MyoD рассматривается как главный игрок в инициировании терминальной дифференцировки мышц 9 </sвверх> , так как он обладает способностью индуцировать программу (транс-дифференциации) миогенная определения / дифференциации во многих полностью дифференцированных систем немышечных 10-13. Действительно, принудительная экспрессия MyoD индуцирует транс-дифференциацию различных клеточных типов , даже те , которые получены из другого эмбриологического происхождения 12. Например, MyoD может конвертировать гепатоциты, фибробласты, меланоциты, нейробласты и адипоциты в мышечные клетки типа. Транс-differentiative действие MyoD включает аномальную активацию миогенный генетической программы (в частности, его генов-мишеней) в не-мышечной среде, сопутствующую к молчанию оригинальной генетической программы (в частности, гены пролиферации).
В пролиферирующих миобластов, MyoD выражается , но не может активировать свои гены – мишени , даже если он связывается с их промоторов 14-16. Таким образом, требование MyoD быть постоянно выражается в недифференцированных миобластов остается довольно EluSIVE. MyoD может подавлять свои гены – мишени из – за набора репрессивных хроматин-модифицирующими ферментов в пролиферирующих миобластов перед загрузкой активации хроматина ферментов 14,17. Например, в пролиферирующих миобластов, MyoD связан с транскрипционной корепрессор KAP-1, гистондезацетилаз (HDACs) и репрессивных метилтрансферазам лизина (КМЦ), в том числе гистона Н3 лизина 9 или H3K9 и H3K27 КМЦ, а также активно подавлять его экспрессию генов-мишеней путем создания локально репрессивной структуры хроматина 14,17. Важно отметить, что в недавнем докладе указывается , что MyoD сама непосредственно метилируется самая H3K9 КМТ G9a приводит к торможению его трансактивирующей деятельности 16.
В эпигенетические механизмы, участвующие в этом транс-дифференциации без мышечных клеток путем MyoD в значительной степени неизвестны. Следует отметить, что некоторые клеточные линии, устойчивые к MyoD-индуцированный транс-дифференцировки. Таким образом, в клетках HeLa, MyoD либо неактивны илидаже может функционировать как репрессор вместо активатора транскрипции из – за отсутствия экспрессии BAF60C субъединицы хроматина комплекс SWI / SNF 18. Таким образом, эта модель может быть выбор, чтобы лучше охарактеризовать механизмы MyoD-индуцированной репрессии генов. Он также подходит для анализа способности MyoD вызывать репрессивную среду хроматина на своей целевой локусов со своими ассоциированными партнерами и , следовательно , раскрыть репрессивные механизмы MyoD-зависимых в пролиферирующих миобластов для тонкой настройки терминальной дифференцировки.
Здесь мы опишем протокол для идентификации партнеров MyoD с помощью Тандем аффинной очистки (TAP-Tag) в сочетании с масс-спектрометрии (МС) характеристики. Использование клеток HeLa-S3, стабильно экспрессирующих Flag-HA-MyoD допускается, чтобы получить достаточное количество материала для очистки MyoD комплексов из фракционированного ядерных экстрактов. Идентификация партнеров MyoD в гетерологичной системе последовали validatiна в соответствующей системе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный метод позволяет исчерпывающую идентификацию партнеров фактора транскрипции, MyoD. Оно показало партнеров MyoD в гетерологичной системе, устойчивой к MyoD-индуцированной дифференцировки, а именно HeLa-S3 клетки. Таким образом, по определению, идентифицированные партнеры MyoD экс?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Ait-Si-Ali lab was supported by the Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot and the ”Who Am I?” Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071 funded by the French Government through its ”Investments for the Future” program operated by the ANR under grant #ANR-11-IDEX-0005-01. EB was supported by an INCa grant.
Materials
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer : Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12 % gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4X loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10X reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
- Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
- Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
- Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
- Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
- Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
- Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
- Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
- Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
- Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
- Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
- Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
- Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
- Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
- Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
- Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
- Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
- Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
- Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
- Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
- Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270 (2007).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
- Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
- Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
- Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858 (2014).
- Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
- Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
- Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
- Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
- Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it’s time to exchange!. Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
- Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
