Retinal pigment epitelet (RPE) erstatning strategier og gen-basert terapi anses for flere retinal degenerative forhold. For klinisk oversettelse blir store øyne dyremodeller som kreves for å studere kirurgiske teknikker som gjelder hos pasienter. Her presenterer vi en kanin modell for subretinal kirurgi rettet mot RPE transplantasjon, som er allsidig og kostnadseffektiv.
Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), retinitis pigmentosa, og andre RPE relaterte sykdommer er de vanligste årsakene til irreversible synstap hos voksne i industrielt utviklede land. RPE transplantasjon synes å være en lovende behandling, da det kan erstatte dysfunksjonelle RPE, gjenopprette dens funksjon, og derved syn.
Her beskriver vi en metode for å transplantere en kultivert RPE monolag på et stillas inn i subretinal plass (SRS) av kaniner. Etter vitrectomy xenotransplants ble levert inn i SRS ved hjelp av en spesiallaget skytespill som består av en 20-gauge metallic munnstykke med en polytetrafluoretylen (PTFE) belagt stempelet. Den nåværende teknikk utviklet seg i over 150 kanin operasjoner over 6 år. Postoperativ oppfølging kan oppnås ved hjelp av ikke-invasiv og repeterende in vivo avbildning slik som spektral domene optisk koherens tomografi (SD-oktober) etterfulgt av perfusjon fiksert histologi.
the metoden har veldefinerte trinn for enkel læring og høy suksessrate. Kaniner er ansett som en stor øye dyremodell nyttige i prekliniske studier for klinisk oversettelse. I denne sammenheng kaniner er en kostnadseffektiv og kanskje praktisk alternativ til andre store øyne dyremodeller.
Aldersrelatert macula degenerasjon (AMD) er den vanligste årsaken til synshemming hos voksne i alderen 50 år eller eldre i industrielt utviklede land, da det fører til tap av sentral visjon. Omtrent 15% av disse pasientene lider av "våt" form av sykdommen, hvor neovaskularisering stammer fra årehinnen og forstyrrer retinal funksjon 1. Denne varianten kan bli behandlet av en meget effektiv terapi med gjentatt intra vitreal injeksjoner av antiangiogene midler 2. Men det store flertallet av pasientene (~ 85%) lider av tørr form, som er preget av ekstracellulære avleiringer (f.eks drusen) under retinal pigment epitel (RPE). Disse forekomstene føre RPE dysfunksjon fører til retinal atrofi i makula. Gitt mangelen på noen helbredende behandlingsalternativer, AMD utviklet seg til et intensivt utvikle forskningsfeltet, hvor mange ulike kurative terapeutiske tilnærminger blir testet. Kirurgisk RPE erstatning eren attraktiv fremtidig mulighet for å bekjempe denne ødeleggende sykdommen 3.
Autolog subretinal RPE transplantasjon erstatter dysfunksjonell eller tapt RPE i makula, og har potensial til å gjenopprette sin fysiologiske funksjon 4-9. Denne kirurgiske teknikken hadde et gjennombrudd med utvikling av RPE differensiering protokoller fra humane embryonale stamceller (hESC) og induserte pluripotente stamceller (IPSC), noe som gir forskeren et ubegrenset celle kilde til RPE for transplantasjon 10. RPE transplantasjon er nå anerkjent som en attraktiv først-i-menneske program for stamcelle avledet therapeutics. Øyet tilbyr utmerket kirurgisk tilgang og sofistikert in vivo overvåkingsverktøy 11-13.
For å transplantere RPE, er en måte med en minimal invasiv levering ved hjelp av en cellesuspensjon, alternativt, for å bedre bevare RPE egenskaper og transplantasjon funksjon, arti fi sielle bære substrAtes (stillas) for RPE erstatning blir vurdert 4,14,15. Store dyremodeller er nødvendig for preklinisk validering, men detaljert teknisk informasjon om dyr håndtering og kirurgisk teknikk mangler hittil 16-23.
Vi og andre 11,24 til tross for noe bevis på det motsatte 25, foreslår bruken av en stiv, men elastisk bæresubstrat som det gir sikrere håndtering, bevarer monolaget integritet og funksjonalitet. Over tid har vi testet flere spesialdesignede instrumenter og tilhørende teknikker for implantering av celle-carrier støttes RPE transplantasjoner inn i subretinal plass (SRS). Vi utnyttet intra videoopptak, in vivo scanning laser ophthalmoscopy kombinert med spektral domene optisk koherens tomografi (SLO / SD-oktober), og histologi å evaluere implantasjon suksess 14,26,27. Her gir vi vår nåværende anbefaling for subretinal RPE implantater i kaniner,som ble testet i 5 forskjellige stammer kanin, 7 celle bærermaterialer og 4 RPE cellekilder i over 150 prosedyrer.
Ved hjelp av en kanin modell, er en trygg og reproduserbar metode presenteres for transvitreal levering av dyrket RPE på cellebærere inn i subretinal plass med en spesialdesignet skytespill instrument. Den beskrevne metoden gir en kort / optimalisert kirurgisk teknikk for enkel læring, som det innebærer standardteknikker i vitrectomy med subretinal manøvrer. Resultatet er sterkt tilrettelagt av en ren vitreoretinal grensesnitt, og intraokulært infusjon som unngår væske turbulens over implantasjonsstedet, indusere bleb netthinneavløsning (BRD) ved lav IOP, hindre netthinnen og sclera skader gjennom tørrhet, og hensiktsmessig plassering av kaninen.
Vi advarer imidlertid som flere intra-operative komplikasjoner kan oppstå når som helst, hindrer suksess for implantasjon, for eksempel intra okulær blødninger, anestesi falming av under viktige skritt som implantasjon, skjuling av BRD grunn instrument manipulering eller okulær hypotoni, rabbit død på grunn av høye doser av anestesi, lavt blodtrykk under lang operasjon forårsaker hypoksisk hjerneskade, eller hypertermi. Men disse komplikasjoner reduseres over tid etter hvert som de blir raskt håndtert og løst ved å øke opplevelsen av det kirurgiske teamet.
Noen komplikasjoner kan reduseres ved å følge noen enkle, men viktige skritt. Smøremiddel bør legges hvert 5. – 10 min for å forhindre hornhinnen, senehinne og konjunktival skade under operasjonen, og for å opprettholde en klar intraokulære media, kan så tørket / svertet sklera være en årsak til sårdehiscens, som i sin tur fører til okulær hypotoni og / eller intraoperativ lekkasje fra sclerotomies. Heparin bør legges for å forhindre dannelsen av et fibrin film som gjør spesielt subretinal implantasjon utfordrende og samtidig legge adrenalin for å redusere blødning etter heparin 16. For lang heparin / adrenalin eksponeringstider (> 1 time) bør unngås for å hindre hornhinnen Edema av endothelial dekompensasjon 33, hypertensiv krise eller intraoperativ dødsfall. Nitid glasslegemet fjerning bør utføres ved instrument (entry) port for å unngå retinal og / eller koroidal avdelinger. Intraokulære instrumenter bør pekte mot bakre pol unngå linse touch (forårsaker iatrogen katarakt) eller (entry stedet) retinal skade. En intraokulær side-port infusjonskanyle bør brukes, som det demper jet stream rundt implantering området, og dermed hindre ukontrollert riving av retinotomy, og kollaps av BRD. BRD induksjon i midtlinjen (vertikal akse fra synsnerven) eller nær optiske medullar fibre bør unngås for å hindre omfattende iatrogenisk retinal avdelinger. Til slutt, sist men ikke minst BRD bør induseres ved lav IOP, for å unngå subretinal BSS injeksjon bruke store strømningsrater som kan føre til en retinal skade (f.eks. Ved å strekke).
Mange studie variabler som celle carrier varianter, foster, voksen eller stamcelle avledet RPE cellekilder, valg for immundempende, osv., kan utforskes 14,26,27,34. Ytterligere forbedring som serumfritt RPE kultur metoder, karakterisering av xenoRPE i subretinal plass, fjerning av verts RPE lag 14 eller strategier for implantat forankring er aktuelle i arbeid.
Hittil de beskrevne teknikker har vært brukt på 5 forskjellige kanin stammer, inkludert chinchilla drittsekk, Chinchilla drittsekk / KBL hybrider, New Zealand Hvit / Røde Kors, New Zealand hvit (albino) og nederlandsk belte. Både mannlige og kvinnelige kaniner ble operert, med kaniner minst 1,5 kg eller 2 måneders alder (avhengig av art). De fleste operasjoner var på pigment kaniner (chinchilla uekte eller chinchilla Bastard hybrider) med en vekt på mellom 2,5 til 3 kg.
Alle kanin stammer vi har hatt muligheten til å jobbe med synes å ha noen særegenheter. Gitt den eksklive tilgjengeligheten av pigmenterte kaniner av chinchilla drittsekk belastningen i Tyskland i 2009-13, har vi samlet de mest erfaring med disse dyrene. Dessverre er det ikke lenger tilgjengelig, siden avl har blitt avviklet, men sammenligner godt til New Zealand Hvit / Røde Kors med unntak av mer fordelaktig tykkere sclera og større øye volumer i det siste. Chinchilla Bastard hybrider har betydelig intraoperativ fibrin dannelse og krever heparin / adrenalin bruk som skissert ovenfor for å sikre vellykkede subretinal manøvrer. Denne protokollen er også utført i ikke-pigmenterte albino kaniner (New Zealand hvite), men spesielt BRD etablering og subretinal implantasjon er mer utfordrende gitt redusert kontrast takknemlighet. Muligheten for å fremkalle et glasslegemeavløsning synes ikke kanin belastning avhengige i våre hender.
Transvitreal subretinal levering er sannsynlig fremtidig kirurgisk strategiske valget gitt det er den mest comm på vei i dag klinisk for å få tilgang til netthinnen. Som et resultat av mange andre grupper har presentert slike teknikker for kultivert RPE på bære støtter i dyre arbeid 11,15,23,35. Aramant et al. 36 har et instrument, som plasserer i stedet skyver deres hydrogel-innkapslet myk implantat til sin subretinal målområdet. Utformingen av Thumann et al. Benytter en hul slikkepott, som frigjør carrier-støttet pode av flytende den av gjennom væske injeksjon 19. Begge tidligere strategier krever subretinal innsetting av instrumentet, som etter vårt syn er mer utsatt for komplikasjoner, sammenlignet med et epiretinally appositioned instrument. Montezuma et al. 22 beskrevet en subretinal inserter instrument for levering av subretinal chip implantater hos gris, men ikke lenger arbeidet har vært utgitt siden til vår beste kunnskap. Vi har vært i stand til å forlenge den beskrevne teknikken med noen modifikasjon av gris.
jove_content "> Vårt foretrukne cellebærerne er 10 mikrometer tykke polyester-tereftalat (PET) membraner. Fra et operasjonsperspektiv, har dette materialet gunstige stivhet og elastisitets parametre, i tillegg til sin brede anvendelighet under cellekultur eksperimenter. Vi fant lignende erfaringer med utvidet tetrafluoretylen (ePTFE) 37 eller nanofiber-membraner elektrospunnede fra PET, poly-melkesyre / capronolactic syre (PLCL) eller poly -. melke-ko-glykolsyre (PLGA), så vel som komposittnanofiber (PLGA eller PET), og ultratynne PET 26 Når PET membraner brukes med vår metallic skytespill instrument, de har en annen tendens til å stille ut statisk elektrisitet, som utfordrer deres utstøting fra skytteren 27. ultratynne polyimide membraner kan i våre hender ikke implanteres i subretinal plass med protokollen skissert ovenfor ( manuskript under forberedelse).Marmor et al. har systematisk studert spontan resorption av subretinal væske i iatrogenisk lokaliserte retinal avdelinger 38-41. Selv etter manipulasjon i subretinal plass disse ble funnet å være absorbert av postoperative dag 4 i begivenhetsløse operasjoner. Laser retinopeksi er ikke utført for å feste kantene av retinotomy. Selv om counterintuitive i forhold til menneskelig kirurgi, er luft / gass tamponade ikke nødvendig. Med mindre grundig fjerning av perifere glasslegemet kan oppnås, spesielt i den overlegne kvadrant, dette kan i virkeligheten resultere i store retinale tårer som stammer fra retinotomy området. Det anbefales kun å utføre væske luftgjennomgang med påfølgende 20% SF6 gass tamponade å berge intra iatrogenisk netthinneløsning eller i tilfelle en bestemt implantat stilling må sikres.
Selv om mekanisk indusert ablasjon av det nevrale netthinnen kan føre RPE og fotoreseptoren skader hos kaniner 42,43, varierer sin utstrekning i stor grad (selv med vanlig BSS) depåvente av faktorer som IOP, sprøytetypen som brukes, injeksjonsvolum med og dermed indusert retinal stretching, osv. Vi har også testet ofte anbefalt Ca / Mg-fri BSS lettere løsgjøring 42-44, men fant at den forårsaker intraoperativ linse opasifisering (spesielt ved forhøyet temperatur), og i betydelig grad forsinker eller forstyrrer retinal re-festing 27. Slow subretinal injeksjon av 20-30 pl volum vanlig BSS med en 100 mL sprøyte anbefales derfor; kanyle bevegelser bør være minimal så retinotomy selene rundt det og hindre Bruch membran skade. Noe av feilbehandling- kan løses ved RPE sårheling, og den observerte relative bevaring av onl tykkelse etter reattachment, tyder på at RPE / fotoreseptoren komplekset kan tolerere dette funksjon, som også beskrevet av andre 45.
Cell-baserte terapeutiske eller retinal proteser krever preklinisk animal testing før myndighetsgodkjennelse og begynner menneskelige sikkerhetsstudier. Den tidligere varierer fra land til land. Kaninen modellen beskrevet her, kan tjene som en kostnadseffektiv og mindre utfordrende plattform for å etablere eller utføre alle kravene til forvaltningsmyndighetene. Videre kan det i ettertid tjene for opplæring av kirurger i eventuelle multisenter kliniske studier eller ytterligere forbedringer av teknikken underveis.
The authors have nothing to disclose.
Støttet av Rüdiger Foundation tilskudd i 2008 og 2010 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0015 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0019 (FT), Deutsche Forschungsgemeinschaft / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, kinesisk Scholarship Council No. 2008627116 (ZL) og en ubegrenset tilskudd av Geuder AG, Heidelberg (fig. 2). Medlemmer av H. Skottman laboratorium, er Universitetet i Tampere Finland takknemlig anerkjent for å gi HMS avledet RPE vist i figur 2.
s30 ultrasonic cleaning unit | Elmasonic | 100 4631 | 2.75L |
DE-23 autoclave | Systec | C 2209 | 23L |
Syringe | BD | 300013 300995 301285 300294 300330 |
1ml x3 2ml x3 5ml x1 10ml x1 20ml x1 |
Needle | BD | 305196 305136 |
18G x 1 27G x5 |
Scalpel | Feather | 2975#20 | blade#20 x3 |
Surgical drape | HARTMANN LOHMANN & RAUSCHER |
277 502 25 440 |
60×40 cm x2 12×17 cm |
Ocular sticks | LOHMANN & RAUSCHER | 16 516 | 66×5 mm |
Twister gauze sponges | HARTMANN | 481 274 | x2 |
Closure strips | HARTMANN | 540 686 | x4 |
Opmi Visu CS Microscope | Zeiss | N/a | incl. fundus imaging system BIOM II |
Chandelier endoillumination | Geuder | G-S03503 + G-S03504 |
25G incl. trocar |
Light machine | Geuder | G-26033 | Xenotron III |
Vitrectomy machine | Geuder | G-60000 | MegaTRON S4 S4/ HPS |
Vitrector | Geuder | G-46301 | MACH2 vitreous cutter 23G |
Venturi cassette | Geuder | G-60700 | |
Sideport-infusion cannula | Geuder | custom | 1x23G |
3-0 silk suture | ETHICON | V546G | x1 |
Caliper | Geuder | G-19135 | x2 |
Vannas scissors | Geuder | G-19777 | x1 |
Sclerotomie blade | Ziemer | 21-2301 | 1x23G 1x20G |
7-0 silk suture | ETHICON | EH6162H | x1 |
Needle holder | Geuder | G-32320 | x2 |
Iris forceps | Geuder | G-18910 | x1 |
Colibri forceps | Geuder | G-18950 | x1 |
Extendible subretinal injection needle | DORC | 1270.EXT | 41G |
VR scissor | Geuder | G-36542 | 25G |
Grieshaber forceps holder | Alcon | 712.00.41 | 23G |
Curved scissor forceps tips | Alcon | 723.52 | 23G |
Implant loading station | Dow Corning | 3097358-1004 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
blunt oval implant trephine | Geuder | custom-made | 2.4 x 1.1 mm |
Shooter dummy | Geuder | G-32227 | x1 |
Shooter | Geuder | G-S03443 | x1 |
Flute needle | DORC | 1281.SD | 20G (Vacuum) |
Manual microliter syringe | Hamilton | 24535 | 100µl |
Tissue culture plates | Greiner bio-one | 664160 | 100 x 20 mm |
Spectralis Multi-Modality Imaging System |
Heidelberg 공학 |
N/a | Spectralis HRA + OCT |
Drugs and solutions | |||
Name | Company | Active agent | Comments |
Mucadont-IS | Merz Hygiene | virucidal instrument disinfectant | 2L |
Mucocit T | Merz Hygiene | Aldehyde-free instrument disinfectant | 2L |
Ketamin 10% | WDT | Ketamine | 10ml (100mg/ml) |
Domitor | Orion Pharma | Medetomidine hydrochloride | 10ml (1mg/ml) |
Antisedan | Orion Pharma | Atipamezole hydrochloride | 10ml (5mg/ml) |
Neosynephrin POS 10% | URSAPHARM | Phenylephrine HCl | 10ml |
Mydriacyl | Alcon | Tropicamid | 10ml (5mg/ml) |
Methocel 2% | Omni Vision | hydroxypropyl methylcellulose | 10g |
PURI CLEAR | ZEISS | Balance salt solution (BSS) | 500ml |
Glucose 5% | B.Braun | Glucose 5% solution | 100ml |
Heparin-Natrium-25 000 | Ratiopharm | Heparin | 5ml (2500 unit/ml) |
Suprarenin | SANOFI | Epinephrine | 1ml (1mg/ml) |
Triamcinolone | University of Bonn pharmacy | preservative-free Triamcinolone | 1ml (40mg/ml) |
Isoptomax eye ointment | Alcon | dexamethasone 1 mg/g neomycin sulfate 3,500 IU/g polymyxin B sulfate 6,000 IU/g |
10ml |
Betaisodona | Mundipharma | Povidon-Iod | 30ml (1g/10ml) |
Optive | ALLERGAN | sodium carboxymethylcellulose glycerol | 10ml |