여기에서는 miRNA in situ hybridization을 사용하여 유방암 환자 샘플에서 miRNA 발현을 검출하는 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 기사에서는 digoxigenin-labeled LNA(Locked Nucleic Acid) 프로브와 함께 in situ hybridization을 사용하여 유방암 조직에서 miRNA를 검출하기 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로브는 anti-DIG 알칼리 인산가수분해효소 항체에 의해 인식되었으며 나중에 형광 신호를 생성하는 알칼리성 인산가수분해효소 기질을 사용하여 개발되었습니다. 여기에서는 miRNA MISH(in situ hybridization) 기술을 활용하여 유방암 환자의 조직에서 miR-489의 발현을 분석했습니다. 이 기술은 개별 조직 샘플에서 관심 miRNA의 국소화를 검출할 수 있습니다. 이 기술은 종양 조직에서 원하는 miRNA의 발현을 인접한 정상 조직에서의 발현과 비교하고 이 miRNA를 발현하는 특정 구조를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 암 발병에서 특정 miRNA의 역할과 같은 특정 임상 질문에 답하는 데 매우 유용할 수 있습니다. 본 연구의 결과는 유방 상피 세포가 인접한 종양 세포보다 훨씬 더 높은 수준의 miR-489를 발현한다는 것을 나타냅니다.
서론
유방암은 전세계 여성 인구에 영향을 미치는 가장 흔한 악성 종양 중 하나입니다. 유방암의 130 만 이상의 경우는 전 세계적으로 1, 2 매년보고됩니다. 종양 세포 전통적 생물학적 균질 높은 증식으로 간주되었지만, 유방암 유전자 임상 이질적인 것을 분명하게 하였다. 유행 항암제에 대한 내성은 암의 진행과 전이 거리 (3)의 촉진을 통해 대부분의 환자에서 사망에 이르는 고급 유방암의 특징이다.
마이크로 RNA (miRNA가)의 mRNA의 번역을 차단하거나 mRNA의 분해 4 중개하여 유전자 발현을 조절하는 약 22 개의 뉴클레오티드 작은 RNA 분자 클래스이다. 2,000 개 이상의 다른의 miRNAs 지금까지 인간의 질병 (5)에 연결되어 인간에서 발견되었습니다. 연구의 증가 배열은 근래전자는의 miRNAs는 종양 유전자와 종양 억제 기능을 할 수 종종 종양 6 조절 곤란 것을 보여 주었다. miRNAs는 강하게 종양 세포 운동성, 침윤 및 전이 (7)의 것들과 함께, 세포주기 진행, 노화, 세포 사멸 및 자식 작용의 주요 레귤레이터를 제어하여 일차 종양 모두 영향을 미친다.
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프로토콜
본 연구는 기관 검토 전남 대학교 화순 병원의 이사회와 사우스 캐롤라이나 대학의 승인을 받았다. 유방암과 일치 인접 정상 유방 조직 구성 TMA 샘플은 전남 대학교 화순 병원, 한국 바이오 뱅크 네트워크의 회원의 바이오 뱅크가 제공되었다.
1. 솔루션 준비
- DNase의와의 RNase 무료 물 1 L를 준비합니다. 디 에틸 피로 카보 (DEPC) 처리 된 물을 사용하는 모든 화학 솔루션을합니다. DEPC 500 μL에 물 1 L를 처리하고, 실온에서 3 시간 동안 배양한다. DEPC을 비활성화하는 물을 압력솥.
주의 :이 발암 물질 알려져 있기 때문에 DEPC를 흡입하지 마십시오. - DEPC 처리 된 물을 사용하여 10 배 PBS에서 1X PBS를 준비합니다.
- , 20 배 SSC (염화나트륨의 175.3 g 및 800 ml의 물에 구연산 나트륨의 88.2 g을 용해 준비의 HCl (14) N 용액 몇 방울 7.0 pH를 조정하고 와트 1 L에 볼륨을 조정ER), 4 % 파라 포름 알데히드, 95 % 에탄올, 80 % 에탄올 DEPC 처리 된 물을 사용.
- 8 트리에탄올 아민 ㎖의 DEPC 처리 된 물 590 ㎖ 중의 염산의 1.05 ML을 추가 및 아세틸 화를....
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결과
인간 유방암 조직의 miRNA-489은 발현을 측정 하였다. 유선 관 상피 세포는 인접한 두 환자에서 종양 조직 (도 1A 및 1B)에 비해 상당히 높은 수준의 miRNA-489를 발현하는 것으로 하였다. 이것은 분명히의 miRNA-489 발현의 miRNA-489 종양 억제 활성을 시사 종양 조직 소실 한 것을 보여준다. 또한 같은 환자에서 이러한 결과, 종양 조직과 인접한 정상 조직을 확인하는 비교 하였다. 도 2a 및도 2b에서 관찰 된 바와 같이, 정상 조직은 인접한 종양 조직보다 더의 miRNA-489을 표현하는 것으로 하였다. 이미지 10 μm의 규모 줄을 나타냅니다. 이미지는 10X 렌즈를 사용하여 수행 하였다.
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토론
이 연구의 목적은 현장에서 miRNA의 혼성화를 사용하여 유방암 조직에서의 miRNA 발현 수준을 결정 하였다. 본 실험에서 모든 조건 유방암 조직에 최적화 된 것을 유의하여야한다. 또한 최적화는 다른 조직 유형에 필요한 될 수 있습니다. 모든 솔루션은 DEPC 물로 만든되어야하며, 모든 컨테이너는 DEPC 처리 수로 세척하고이어서 멸균해야 사용할 수 있습니다. 비록 약간의 오염 된 RNase 실험의 최종 결과를 방해 할 수있다. miRNA는 매우 짧은 시퀀스이기 때문에, 그 타겟과 더 잘 혼성화를 촉진하는 LNA 프로브를 사용하는 것이 필요하다. 또한,의 RNase없는 테 K와 조직을 고정, 치료 후 다른 단백질이 내생의 miRNA와 프로브의 하이브리드을 방해 할 수 있습니다 절대적으로 필요하다. 또한, 프로브를 조직 절편을 배양하기 전에, 후자는 95 비등해야 어떤을 펼쳐 C를 °이차 구조.
밤새 배양 한 결과, 비특이적 결합을 감소.......
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공개 사항
공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 NIH 보조금(5R01 CA178386-03) 및 HC에 대한 USC ASPIRE-1 보조금의 지원을 받았습니다. 원고에 도움을 주신 Vrushab Gowda에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ELF-97 | 라이프 테크놀로지 | E6604 | |
| 50x Denhard't | 생명 기술 | ||
| t-RNA | Roche | 109541 | DEPC 물 |
| 청어 정자 DNA | nbsp; | D1815 | |
| 로슈 차단 | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | 사용 전에 16.1 RCF에서 스핀다운하고 상층액을 복용하십시오 |
| miR-489 프로브 | Exiqon | 38599-01 | |
| 뉴클레아제 무료 BSA | Roche | ||
| 1차 항체-anti DIG | Roche | ||
| 디에틸 피로카보네이트 | 시그마 | 1609478 |
참고문헌
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 sup....
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재인쇄 및 허가
