Procedure for at vurdere effektiviteten af ​​flokkuleringsmidler til fjernelse af dispergerede partikler fra planteekstrakter

Summary

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Abstract

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

Introduction

Planter er vidt anvendt til at producere fødevarer råvarer som frugtjuice, men de kan også udvikles som platforme til fremstilling af højere værdi biofarmaceutiske produkter ^1-3. I begge tilfælde nedstrøms (DSP) begynder ofte med udvinding af væsker fra væv såsom blade eller frugter, efterfulgt af afklaringen af partikel-lastet ekstrakter ^4,5. Til fremstilling af biofarmaceutiske, kan omkostningerne ved DSP udgøre op til 80% af de samlede produktionsomkostninger ^6,7, og dette til dels afspejler den høje partikel byrde stede i ekstrakter fremstillet af forstyrrende metoder såsom klinge-baserede homogenisering ^8,9 . Selv rationel udvælgelse af filterlag, der passer partikelstørrelsesfordelingen i ekstrakten kan øge filter kapacitet og reducere omkostningerne ^10,11, kan forbedringen aldrig overstige loftet for absolut kapacitet defineres af antallet af partikler, der beholdes prenhed af filterareal at opnå afklaring.

Loftet kan ophæves, hvis færre partikler nå overfladen af de fineste filtre i filtrering toget, og dette kan opnås, hvis dispergerede partikler er blandet med polymerer kendt som flokkuleringsmidler, der fremmer sammenlægning til at danne store flokke ^12. Sådanne flokke kan tilbageholdes længere opstrøms ved grovere og mindre dyre posefiltre, hvilket reducerer partikel byrde nå finere og dyrere dybdefiltre. Polymererne skal have sikkerhedsprofil er egnede til deres formål, f.eks til biofarmaceutiske de skal være i overensstemmelse med god fremstillingspraksis (GMP), og typisk skal de have en molær masse> 100 kDa og kan enten være neutral eller opkrævet ^13. Ud fra følgende betragtninger neutrale flokkuleringsmidler generelt virker ved krydsbinding dispergerede partikler forårsager deres sammenlægning og dannelse af flokke med diametre> 1 mm ^11, ladede polymerer neutralisere ladningen af dispersed partikler, hvilket reducerer deres opløselighed og dermed forårsager nedbør ^14.

Flokkulering kan forbedres ved at justere parametre såsom pH eller konduktivitet, og polymeren type eller koncentration, der svarer egenskaberne af ekstraktet ^15,16. For tobak ekstrakter forbehandlet med 0,5-5,0 g L ^-1 polyethylenimin (PEI), en større end 2 gange stigning i dybden filter kapaciteten blev rapporteret i et 100-L pilotskala proces. Omkostningerne ved denne polymer er mindre end € 10 kg ^-1 så sin introduktion i processen resulterede i besparelser på omkring € 6000 for filtre og hjælpematerialer pr parti ¹⁶ eller endnu mere, når det kombineres med cellulose-baseret filter hjælpemidler ^17. Alligevel er prognosemodeller forpligtet til at vurdere de a priori økonomiske fordele ved flokkuleringsmidler fordi deres optagelse kan kræve hold trin på 15-30 min ^16,18, hvilket resulterer i yderligere investeringsomkostninger for opbevaringtanke. Men der er i øjeblikket ingen mekanistiske modeller, der kan forudsige resultatet af sådanne forsøg på grund af den komplekse karakter af flokkulering. Derfor blev en mere passende design-for-eksperimenter (DOE) tilgang ¹⁹ udviklet som beskrevet i denne artikel. En protokol til den almindelige DoE fremgangsmåde er for nylig blevet offentliggjort ^20.

Små enheder er nu tilgængelige for high-throughput screening af flokkulering vilkår ^21. Imidlertid kan disse anordninger ikke realistisk simulere betingelser under flokkulering af planteekstrakter fordi dimensionerne af reaktionsbeholderen (~ 7 mm for brønde på en plade med 96 brønde) og partiklerne eller flokkene kan være mindre end en størrelsesorden fra hinanden. Dette kan påvirke blande mønstre og dermed den prædiktive effekt af modellen. Desuden kan det være vanskeligt at nedskalere processer, der involverer udfældning på grund af ikke-lineære ændringer i blanding adfærd og bundfald stahed ^22. Derfor er denne artikel beskriver en bench-top-skala screening system med en kapacitet på 50-75 prøver om dagen, hvilket giver resultater, der er skalerbar fra den oprindelige 20 ml reaktion volumen til et 100 L pilotskala proces ^16. Når det kombineres med en doe tilgang, tillader dette prædiktive modeller, der skal anvendes til procesoptimering og dokumentation som del af en kvalitet-by-design koncept.

Den nedenfor beskrevne metode kan også tilpasses til biofarmaceutiske produceret i cellekultur-baserede processer, hvor flokkuleringsmidler bliver også betragtes som en omkostningsbesparende værktøj ^23. Den kan også bruges til at modellere udfældning af målproteiner fra et råt ekstrakt som en del af en rensning strategi, som demonstreret for β-glucuronidase produceret i raps, majs og sojabønne ^24,25. En detaljeret beskrivelse af flokkuleringsmiddel egenskaber kan findes andre steder ^16,26 og det er vigtigt at sikre, at polymeren concentrtioner er enten ikke-giftige eller under skadelige niveauer i det endelige produkt ^11.

Protocol

1. Udvikle en tilstrækkelig eksperimentel strategi Identificer de miljømæssige og procesparametre, der er relevante for flokkulering procedure, der skal etableres eller optimeret, dvs. hvilke faktorer har den stærkeste effekt på flokkulering. Typisk er der flere sådanne parametre så en doe metode som for nylig beskrevet 20 er nødvendig på grund af manglen på mekanistiske modeller. Vælg parametre (faktorer) baseret på data fra litteraturen 12, forudgående vi…

Representative Results

Flokkulering af tobaksekstrakt med forskellige polymerer Den ovenfor beskrevne metode blev med held anvendt til at udvikle en fremgangsmåde til flokkulering af tobaksekstrakter under fremstillingen af et monoklonalt antistof (HIV-neutraliserende antistof 2G12) og et fluorescerende protein (DsRed) (figur 1) 16, og er siden blevet overført til andre proteiner, herunder lectiner, malaria vaccinekandi…

Discussion

Det vigtigste aspekt at overveje, når du konfigurerer en DoE at karakterisere partikel flokkulering er, at designet i princippet skal kunne opdage og beskrive de forventede eller mulige virkninger ^36,38, fx påvirkning af pH, polymer type og polymerkoncentrationen ^16. Derfor er det vigtigt at evaluere den del af design plads (FDS) inden starten de faktiske eksperimenter. Den FDS er den del af den flerdimensionale eksperimentelle rum (omfattet af design faktorer, fx pH), inden for…

Materials

2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR device
BP-410	Furh	2632410001	Bag filter
Catiofast VSH	BASF	79002360	Flocculating agent
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Centrifuge tube 15 mL	Labomedic	2017106	Reaction tube
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chitosan	Carl Roth GmbH	5375.1	Flocculating agent
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	102446	Rockwool block
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
K700P 60D	Pall	5302305	Depth filter layer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Polymin P	BASF	79002360	Flocculating agent
POLYTRON PT 6100 D	Kinematica	11010110	Homogenization device with custom blade tool
Protein A	Life technologies	10-1006	Antibody binding protein
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS particle size distribution measurement