Procédure pour évaluer l'efficacité de floculants pour l'élimination des particules dispersées dans des extraits de plantes

Summary

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Abstract

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

Introduction

Les plantes sont largement utilisées pour produire des produits alimentaires tels que les jus de fruits, mais ils peuvent aussi être développés comme des plates – formes pour la fabrication de plus forte valeur ajoutée des produits biopharmaceutiques ^1-3. Dans les deux cas, le traitement en aval (DSP) commence souvent par l'extraction de liquides à partir de tissus tels que les feuilles ou les fruits, suivie par la clarification des extraits chargés de particules de ^4,5. Pour la fabrication de produits biopharmaceutiques, les coûts de DSP peuvent représenter jusqu'à 80% des coûts de production globaux ^6,7 et cela reflète en partie la forte charge des particules présentes dans des extraits préparés par des méthodes perturbatrices telles que l' homogénéisation à base de lame ^8,9 . Bien que la sélection rationnelle des couches de filtre pour correspondre à la distribution des tailles de particules dans l'extrait peut augmenter la capacité de filtrage et de réduire les coûts ^10,11, l'amélioration ne peut jamais dépasser la limite de capacité absolue définie par le nombre de particules qui doivent être retenues parunité de surface de filtre pour obtenir des éclaircissements.

Le plafond peut être levée si moins de particules atteignent la surface des meilleurs filtres dans le train de filtration, et ceci peut être réalisé que si les particules dispersées sont mélangées avec des polymères connus comme agents floculants qui favorisent l' agrégation pour former de grands floculats ^12. Ces flocs peuvent être conservés plus en amont par des filtres grossiers et moins coûteux sac, ce qui réduit la charge de particules atteignant la plus fine et les filtres de profondeur plus chers. Les polymères doivent avoir des profils de sécurité adaptés à leurs applications, par exemple pour les produits biopharmaceutiques , ils doivent être conformes aux bonnes pratiques de fabrication (BPF), et généralement , ils doivent avoir une masse molaire> 100 kDa et peut être soit neutre ou chargé ^13. Considérant que floculants neutres agissent généralement par réticulation des particules dispersées provoquant leur agrégation et la formation de flocs avec des diamètres> 1 mm ^11, des polymères chargés de neutraliser la charge de dparticules ispersed, réduisant leur solubilité et provoquant ainsi la précipitation ^14.

La floculation peut être améliorée en ajustant des paramètres tels que le pH du tampon ou de la conductivité et du type de polymère ou de concentration, en fonction des propriétés de l'extrait ^15,16. Pour les extraits de tabac prétraités avec 0,5-5,0 g L ^-1 polyéthylènimine (PEI), une augmentation de plus de 2 fois la capacité de filtration en profondeur a été rapporté dans un processus à l' échelle pilote 100-L. Le coût de ce polymère est inférieure à 10 € kg ^-1 de sorte que son introduction dans le processus ont entraîné des économies de coûts d'environ € 6.000 pour les filtres et consommables par lot ¹⁶ ou encore plus lorsqu'il est combiné avec base de cellulose filtre aides ^17. Même ainsi, les modèles prédictifs sont nécessaires pour évaluer les a priori des avantages économiques de floculants parce que leur inclusion peut nécessiter des étapes de maintien de 15-30 min ^16,18, ce qui entraîne des coûts supplémentaires d'investissement pour le stockageles chars. Cependant, il n'y a pas de modèles mécanistes disponibles qui peuvent prédire les résultats de ces expériences en raison de la nature complexe de la floculation. Par conséquent, une expérience de conception de-plus appropriés (DoE) approche ¹⁹ a été développé comme décrit dans cet article. Un protocole pour la procédure générale DoE a récemment été publiée ^20.

Dispositifs à petite échelle sont maintenant disponibles pour le criblage à haut débit des conditions de floculation ^21. Toutefois, ces dispositifs ne peuvent pas simuler de façon réaliste les conditions au cours de la floculation des extraits de plantes, car les dimensions du récipient de réaction (~ 7 mm pour les puits sur une plaque à 96 puits) et les particules ou flocs peuvent être inférieur à un ordre de grandeur d'intervalle. Cela peut affecter le mélange des modèles et donc la puissance prédictive du modèle. En outre, il peut être difficile de réduire les processus impliquant la précipitation en raison de changements non linéaires dans la conduite de mélange et le précipité stabilité ^22. Par conséquent, cet article décrit un système de criblage paillasse échelle avec un débit de 50-75 échantillons par jour, ce qui donne des résultats qui sont évolutives à partir du volume de réaction de 20 ml initiale à un processus à l'échelle pilote 100 L ^16. Lorsqu'il est combiné avec une approche DoE, ce qui permet aux modèles prédictifs pour être utilisés pour l'optimisation des processus et de la documentation dans le cadre d'un concept de qualité par la conception.

La méthode décrite ci – dessous peut également être adapté aux produits biopharmaceutiques produites dans des procédés à base de culture cellulaire, où les floculants sont également considérés comme un outil de réduction des coûts ^23. Il peut également être utilisé pour modéliser la précipitation des protéines cibles à partir d' un extrait brut dans le cadre d'une stratégie de purification, comme l'a démontré pour la β-glucuronidase produite dans le canola, le maïs et le soja ^24,25. Une description détaillée des propriétés de floculant peut se trouver ailleurs ^16,26 et il est important de veiller à ce que le polymère concentrations sont soit non toxique ou au- dessous des niveaux nocifs dans le produit final ^11.

Protocol

1. Élaborer une stratégie expérimentale adéquate Identifier les paramètres environnementaux et de processus qui sont pertinentes pour la procédure de floculation à établir ou optimisé, à savoir quels facteurs ont le plus d' effet sur ​​la floculation. En règle générale, il existe plusieurs paramètres pour une approche DoE comme récemment décrit 20 est nécessaire en raison de l'absence de modèles mécanistes. Sélectionnez les paramètres (facteurs) su…

Representative Results

Floculation de l'extrait de tabac avec différents polymères Le procédé décrit ci – dessus a été utilisée avec succès pour développer un procédé pour la floculation des extraits de tabac lors de la fabrication d'un anticorps monoclonal (l'anticorps anti – VIH neutralisant 2G12) et une protéine fluorescente (DsRed) (figure 1) 16, et a depuis été transféré à d'autres p…

Discussion

L'aspect le plus important à considérer lors de la mise en place d' un DoE pour caractériser la floculation des particules est que la conception doit en principe être en mesure de détecter et de décrire les effets prévus ou possibles ^36,38, par exemple l'influence du pH, le type de polymère et la concentration de polymère ^16. Par conséquent, il est important d'évaluer la fraction de l'espace de conception (FDS) avant de commencer les expériences réelles. Fd…

Materials

2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR device
BP-410	Furh	2632410001	Bag filter
Catiofast VSH	BASF	79002360	Flocculating agent
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Centrifuge tube 15 mL	Labomedic	2017106	Reaction tube
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chitosan	Carl Roth GmbH	5375.1	Flocculating agent
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	102446	Rockwool block
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
K700P 60D	Pall	5302305	Depth filter layer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Polymin P	BASF	79002360	Flocculating agent
POLYTRON PT 6100 D	Kinematica	11010110	Homogenization device with custom blade tool
Protein A	Life technologies	10-1006	Antibody binding protein
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS particle size distribution measurement