LC-MS تحليل الصفائح الدموية البشرية باعتبارها منصة لدراسة الميتوكوندريا الأيض
Summary
نحن هنا تظهر الصفائح الدموية البشرية معزولة يمكن استخدامها بوصفها الوصول فيفو السابقين نموذج لدراسة التعديلات التمثيل الغذائي ردا على مجمع أنا المانع روتينون. هذا النهج يعمل تتبع النظائر وتقدير نسبي من قبل السائل الطيف اللوني الشامل ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من التصاميم الدراسة.
Abstract
Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.
Introduction
وقد تورط استقلاب الميتوكوندريا المختلة وظيفيا في مجموعة واسعة من الأمراض بما فيها التنكس العصبي، والسرطان، وأمراض القلب والأوعية الدموية 30. على هذا النحو، وقد انصب جهد كبير على تميز عيوب التمثيل الغذائي التي تسهم في التسبب بالمرض. يعتبر السائل اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS) المعيار الذهبي لتقدير حجم التحاليل من مصفوفات بيولوجية معقدة، وغالبا ما تستخدم للدراسات التمثيل الغذائي 8. لكن، وكما هو الحال مع الدراسات الطبية الحيوية، وتحقيق نموذج للوصول واضحة المعالم ذات الصلة إلى الأمراض التي تصيب البشر في كثير من الأحيان هو التحدي.
العديد من الدراسات توظف تحويل نماذج الخلوية لبحث تأثير الاكسيوبيوتك أو خلل وراثي في استقلاب الخلايا 7،9. إعادة برمجة التمثيل الغذائي الذي يحدث في الخلايا السرطانية يمكن أن يعرض الخلط عوامل 21، وبالتالي ليست مثالية. ويمكن لهذه القضايا أن يكون circumvented مع نماذج الخلية الأولية، على الرغم من أن الحصول على الكتلة الحيوية ما يكفي لتحليل التمثيل الغذائي يمكن أن يكون تحديا. وعلاوة على ذلك، تم تسليط الضوء على تأثير كميات عالية من المضادات الحيوية المستخدمة في الثقافة باعتبارها دراسات الميتوكوندريا يحتمل الخلط 16.
الصفائح الدموية البشرية تحمل الفرصة للاستفادة من نموذج الخلية الأولية مع محتوى الميتوكوندريا كافية للدراسات التمثيل الغذائي 5،22،27،32. أولا، الصفائح الدموية ويمكن الحصول عليها بسهولة، من خلال توجه الدم من المتبرعين الفردية، أو بكميات كبيرة من بنوك الدم، وبالتالي تقدم نموذجا في العوامل الخارجية التي يمكن السيطرة عليها بسهولة. ثانيا، نظرا لصغر حجمها، والصفائح الدموية يمكن عزلها من مكونات الدم الأخرى مع العمل التحضيري الحد الأدنى في مختبرات مجهزة حتى الحد الأدنى 5. وتجدر الإشارة، الصفائح الدموية لا تحتوي على نواة، وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة تعديلات على عملية التمثيل الغذائي بشكل مستقل من تنظيم النسخي. نحن هنا تبين أنبالإضافة إلى تقدير النسبي (لجنة الزراعة) ثيو إستر أسيل-أنزيم، ونظام الصفائح الدموية معزولة يمكن استخدامها لدراسة التمثيل الغذائي الكربون. على وجه التحديد، ونحن التقرير استخدام العلامات الأيض مع النظائر المستقرة (غير المشعة) المسمى [13 C 6] -glucose و[13 C 16] -palmitate للتحقيق إدماج [13 C] -label في acetyl- الأيض مهم لجنة الزراعة عن طريق تحلل أو أكسدة الأحماض الدهنية. وهذا يوفر منصة قوية، للتعميم، وتنوعا نظرا لمشاركة واسعة من الأنواع أسيل، لجنة الزراعة في المسارات البيوكيميائية 13،24 وقابلية الإستطراق من هذا النظام لاختبار المتغيرات الأخرى، مثل تثبيط أنا معقدة مع روتينون 3،33. بالإضافة إلى المعلومات المنصوص عليها في البروتوكول أدناه، وصفا واسعة من الأساليب المستخدمة لوضع العلامات النظائر والتحليلات تستند LC-MS-يمكن العثور عليها في باسو وبلير 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا أثبتنا فائدة الصفائح المعزولة كمنصة لدراسة مضطرب استقلاب الميتوكوندريا. على وجه التحديد، فقد تميزت التكيف الأيضي ردا على تثبيط أنا معقدة من روتينون.
وسعت الدراسة النتائج ذكرت سابقا حول دور تثبيط أنا معقدة من روتينون في خطوط …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح P30ES013508 وT32ES019851.
Materials
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 mL Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 mL Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
- Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
- Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
- Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
- Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
- Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
- Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
- Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
- Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
- Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
- Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
- Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
- Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
- Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson’s disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
- Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
- Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
- Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
- Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
- Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
- Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
- Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
- Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
- Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
- Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
- Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
- Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich’s ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
- Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).
