ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析
Summary
ここでは、単離されたヒト血小板は私がロテノンを阻害複雑に応じて代謝適応を研究するためにアクセス可能なex vivoでのモデルとして使用できることを示します。このアプローチは、液体クロマトグラフィー – 質量分析法によって同位体トレースおよび相対的定量化を使用し、研究デザインの多様に適用することができます。
Abstract
Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.
Introduction
機能不全のミトコンドリアの代謝は、神経変性、癌、および心血管疾患30を含む広範囲の疾患に関与しています。このように、多大な努力は、疾患の病因に寄与する代謝欠陥を特徴付ける上に置かれています。液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS / MS）は、複雑な生物学的マトリックスからの分析物の定量のためのゴールドスタンダードと考えられ、多くの場合、代謝研究の8のために使用されます。多くの場合、生物医学研究の場合のようにしかし、ヒトの疾患に関連するアクセスと明確に定義されたモデルを達成することが課題です。
多くの研究は、細胞の代謝7,9上の生体異物または遺伝的異常の影響をプロービングするための細胞モデルを変革採用します。癌細胞において起こる代謝再プログラミングは、交絡因子21を導入し 、従って、理想的ではないことができます。これらの問題はcircumveすることができます代謝分析のために十分なバイオマスを得ることが困難な場合がありますが、一次電池モデルとnted。また、培養に用いられる抗生物質の多量の影響は、潜在的な交絡ミトコンドリア研究16として強調されています。
ヒト血小板は、代謝研究5,22,27,32のための十分なミトコンドリアのコンテンツを持つ一次細胞モデルを利用する機会を与えます。血液は、個々のドナーから、または血液銀行から大量に描画し、したがって外部要因を容易に制御することができるモデルを提供〜第血小板を容易に取得することができます。第二に、それらの小さいサイズのために、血小板は容易も最小限備え実験室5内の最小の準備作業で他の血液成分から単離することができます。注目すべきは、血小板は核を含有しないため、独立して転写調節の代謝に変化を研究するために使用することができます。ここでは、ことを示していますアシル – コエンザイムA（COA）チオエステルの相対的定量化に加えて、単離された血小板のシステムは、炭素代謝を調べるために使用することができます。具体的には、我々は重要な代謝産物のアセチルへの[13 C] -labelの取り込みを調べるために安定同位体（非放射性）標識された[13 C 6] -グルコースおよび[13 C 16]パルミチンで代謝標識の使用を報告しますCoAの糖または脂肪酸酸化を介し。これは、生化学的経路13,24におけるアシルCoA種の広範な関与と、このようなロテノン3,33との複合体Iの阻害などの他の変数を、テストするには、このシステムの扱い易に、強力な一般化、および汎用性の高いプラットフォームを提供します。以下のプロトコルで提供される情報に加えて、同位体標識のためとLC-MSベースの分析のために使用される方法の広範な説明はBasuさんとブレア4に記載されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、摂動ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとして、単離された血小板の有用性を示しています。具体的には、ロテノンにより複合体Iの阻害に応答して、代謝適応を特徴としています。
本研究は、ヒト血小板の細胞株におけるロテノンによって複合体I阻害の役割に以前に報告の調査結果を拡張しました。重要なことに、これはロテノンはまた…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、NIHの助成金P30ES013508とT32ES019851のサポートを認めます。
Materials
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 mL Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 mL Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
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