Mitokondriyal Metabolizma incelenmesi için Platform olarak İnsan Trombositler LC-MS Analizi
Summary
Burada izole edilmiş insan trombosit Ben rotenone inhibitör kompleksi cevaben metabolik uyarlamalar incelemek için ex vivo olarak erişilebilir bir şekilde modeli kullanılabilir göstermektedir. Bu yaklaşım, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile izotopik izleme ve nispi miktarını kullanır ve çalışma düzeni, çeşitli uygulanabilir.
Abstract
Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.
Introduction
Fonksiyonel mitokondriyal metabolizma nörodejenerasyonu, kanser ve kardiyovasküler hastalıklar 30 dahil olmak üzere hastalıkların geniş bir implike edilmiştir. Bu nedenle, büyük çaba hastalık patogenezinde katkıda metabolik kusurları karakterize konulmuş. Sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS / MS) kompleks biyolojik matrisler analitlerin miktar altın standart olarak kabul edilir ve genellikle metabolik çalışmalar 8 için kullanılmaktadır. Genellikle insan hastalığı ile ilgili erişilebilir ve iyi tanımlanmış bir model elde biyomedikal çalışmalarda durumda, Ancak, bir meydan okumadır.
Birçok çalışma hücre metabolizması 7,9 tarihinde ksenobiyotikler veya genetik anormalliklerin etkisini sondalama için hücresel modeller dönüştürdü çalıştırırız. Kafa karıştırıcı tanıtabilirsiniz kanser hücrelerinde meydana metabolik yeniden programlama 21 faktörleri ve bu nedenle ideal değildir. Bu sorunlar, circumve olabilirMetabolik analizler için yeterli biyokütle elde zor olabilir, ancak birincil hücre modelleri ile nted. Dahası, kültürde kullanılan antibiyotiklere yüksek miktarda etkisi potansiyel karıştırıcı mitokondriyal çalışmalar 16 olarak vurgulanmıştır.
İnsan trombosit metabolik çalışmalar 5,22,27,32 için yeterli mitokondriyal içeriğe sahip bir birincil hücre modeli kullanmak için fırsat tanıyacaktır. Kan bireysel donörden ya da kan bankalarından büyük hacimlerde çizer ve bu nedenle dış etkenler kolayca kontrol edilebileceği bir model üzerinden ilk, trombositler kolayca elde edilebilir. İkincisi, nedeniyle küçük boyutu, trombositler bile kolayca minimal donanımlı laboratuvarlarda 5 minimal hazırlık çalışmaları ile diğer kan bileşenleri izole edilebilir. Unutmayın ki, trombositler çekirdekleri içermez ve bu nedenle bağımsız transkripsiyonel düzenleme metabolizması değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Burada olduğunu göstermektedirasil-koenzim A (CoA) tiyoesterleri rölatif ölçümü ek olarak, izole edilmiş trombosit sistemi karbon metabolizması incelemek için kullanılabilir. Özellikle, önemli metaboliti asetil- içine [13 C] -Label birleşmesini prob kararlı izotop (radyoaktif olmayan) etiketli [13 C 6] -glükoz ve [13 ° C 16] -palmitat içerebilir ile metabolik etiketleme kullandığını rapor KoA glikoliz veya yağ asidi oksidasyonu yoluyla. Bu durum biyokimyasal yollar 13,24 asil-KoA türlerinin yaygın tutulumu ve bu rotenone 3,33 karmaşık I inhibisyonu gibi diğer değişkenler, test için bu sistemin tractability bir, güçlü genellenebilir ve çok yönlü bir platform sağlar. Aşağıdaki Protokolde verilen bilgilere ek olarak, izotop etiketleme ve LC-MS-tabanlı analizler için kullanılan yöntemlerin geniş bir açıklama Basu ve Blair 4 bulunabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tedirgin mitokondriyal metabolizmayı incelemek için bir platform olarak izole trombosit yarar göstermiştir. Özellikle, rotenone kompleks I inhibisyonu cevaben metabolik adaptasyon özelliği var.
Bu çalışmada, insan trombositleri hücre hatlarında rotenone karmaşık bir önlenmesindeki rolünü daha önce bildirilen bulgular genişletmiştir. Daha da önemlisi, bu rotenon da inhibe trombosit süksinil-CoA oluşumu, trombosit βHB-CoA bir artışını ve asetil-CoA'nın t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz NIH hibe P30ES013508 ve T32ES019851 desteğini kabul.
Materials
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 mL Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 mL Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
- Ault, K. A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Semin. Hematol. 38 (2), 160-168 (2001).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120 (4), 248-251 (2012).
- Basu, S. S., Blair, I. A. Rotenone-mediated changes in intracellular coenzyme A thioester levels: implications for mitochondrial dysfunction. Chem. Res. Toxicol. 24 (10), 1630-1632 (2011).
- Basu, S. S., Blair, I. A. SILEC: a protocol for generating and using isotopically labeled coenzyme A mass spectrometry standards. Nat. Protoc. 7 (1), 1-12 (2012).
- Basu, S. S., Deutsch, E. C., Schmaier, A. A., Lynch, D. R., Blair, I. A. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34 (2), 261-269 (2001).
- Castell, J. V., Jover, R., Martinez-Jimenez, C. P., Gomez-Lechon, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert. Opin. Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2 (2), 311-341 (2010).
- Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 26 (9), 877-890 (2012).
- Darnell, M., Weidolf, L. Metabolism of xenobiotic carboxylic acids: focus on coenzyme A conjugation, reactivity, and interference with lipid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 26 (8), 1139-1155 (2013).
- Des Rosiers, C., Fernandez, C. A., David, F., Brunengraber, H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates. J. Biol. Chem. 269 (44), 27179-27182 (1994).
- Ellis, J. K., et al. Metabolic profiling detects early effects of environmental and lifestyle exposure to cadmium in a human population. BMC. Med. 10, 61 (2012).
- Grevengoed, T. J., Klett, E. L., Coleman, R. A. Acyl-CoA metabolism and partitioning. Annu. Rev. Nutr. 34, 1-30 (2014).
- Haynes, C. A., et al. Quantitation of fatty acyl-coenzyme As in mammalian cells by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Lipid Res. 49 (5), 1113-1125 (2008).
- Ikegawa, S., et al. Characterization of cholyl-adenylate in rat liver microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry. Anal. Biochem. 266 (1), 125-132 (1999).
- Kalghatgi, S., et al. Bactericidal antibiotics induce mitochondrial dysfunction and oxidative damage in Mammalian cells. Sci. Transl. Med. 5 (192), 192ra85 (2013).
- Liu, X., et al. High-Resolution Metabolomics with Acyl-CoA Profiling Reveals Widespread Remodeling in Response to Diet. Mol. Cell Proteomics. 14 (6), 1489-1500 (2015).
- Lopez-Gallardo, E., Iceta, R., Iglesias, E., Montoya, J., Ruiz-Pesini, E. OXPHOS toxicogenomics and Parkinson’s disease. Mutat. Res. 728 (3), 98-106 (2011).
- Magnes, C., Sinner, F. M., Regittnig, W., Pieber, T. R. LC/MS/MS method for quantitative determination of long-chain fatty acyl-CoAs. Anal. Chem. 77 (9), 2889-2894 (2005).
- Mauriala, T., Herzig, K. H., Heinonen, M., Idziak, J., Auriola, S. Determination of long-chain fatty acid acyl-coenzyme A compounds using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 808 (2), 263-268 (2004).
- Murphy, T. A., Dang, C. V., Young, J. D. Isotopically nonstationary 13C flux analysis of Myc-induced metabolic reprogramming in B-cells. Metab Eng. 15, 206-217 (2013).
- Paglia, G., et al. Metabolomic analysis of platelets during storage: a comparison between apheresis- and buffy coat-derived platelet concentrates. Transfusion. 55 (2), 301-313 (2015).
- Patti, G. J. Separation strategies for untargeted metabolomics. J. Sep. Sci. 34 (24), 3460-3469 (2011).
- Robishaw, J. D., Neely, J. R. Coenzyme A metabolism. Am. J. Physiol. 248 (1 Pt 1), E1-E9 (1985).
- Rodgers, G. M. Overview of platelet physiology and laboratory evaluation of platelet function. Clin. Obstet. Gynecol. 42 (2), 349-359 (1999).
- Salles, I., et al. Development of a high-throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet-rich plasma or whole blood. Thromb. Haemost. 104 (2), 392-401 (2010).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Worth, A. J., Mesaros, C., Blair, I. A. Metabolism of propionic acid to a novel acyl-coenzyme A thioester by mammalian cell lines and platelets. J. Lipid Res. 56 (1), 142-150 (2015).
- Snyder, N. W., Basu, S. S., Zhou, Z., Worth, A. J., Blair, I. A. Stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry analysis of cellular and tissue medium- and long-chain acyl-coenzyme A thioesters. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (16), 1840-1848 (2014).
- Snyder, N. W., et al. Production of stable isotope-labeled acyl-coenzyme A thioesters by yeast stable isotope labeling by essential nutrients in cell culture. Anal. Biochem. 474, 59-65 (2015).
- Wallace, D. C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science. 283 (5407), 1482-1488 (1999).
- Wojtovich, A. P., Brookes, P. S. The complex II inhibitor atpenin A5 protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via activation of mitochondrial KATP channels. Basic Res. Cardiol. 104 (2), 121-129 (2009).
- Worth, A. J., et al. Stable isotopes and LC-MS for monitoring metabolic disturbances in Friedreich’s ataxia platelets. Bioanalysis. 7 (15), 1843-1855 (2015).
- Worth, A. J., Basu, S. S., Snyder, N. W., Mesaros, C., Blair, I. A. Inhibition of neuronal cell mitochondrial complex I with rotenone increases lipid beta-oxidation, supporting acetyl-coenzyme A levels. J. Biol. Chem. 289 (39), 26895-26903 (2014).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123 (2), 172-183 (2005).
