Immobilisering av Multi-biocatalysts i alginatkuler for kofaktor Regeneration og forbedret Reusability

Summary

Presentert er protokollen for ko-immobiliserte biokatalysatorer hel-celle for regenerering kofaktor og forbedret gjenbruk, ved hjelp av produksjon av L-xylulose som et eksempel. Kofaktor regenereringen oppnås ved kobling av to Escherichia coli-stammer som uttrykker funksjonelt komplementære enzymer; hel-celle biokatalysator immobilisering oppnås ved celle innkapsling i kalsium alginatkuler.

Abstract

Vi har nylig utviklet en enkel, gjenbrukbar og koplet hel-celle biokatalytisk system med mulighet for kofaktor regenerering og biokatalysator immobilisering for økt produksjonsutbytte og vedvarende syntese. Beskrevet herved er den eksperimentelle fremgangsmåte for utvikling av et slikt system som består av to E. coli-stammer som uttrykker funksjonelt utfyllende enzymer. Til sammen kan disse to enzymer fungere samarbeide for å megle regenerering av dyre kofaktorer for å forbedre produktutbytte av bioreaction. I tillegg er rapportert fremgangsmåte for å syntetisere en immobilisert form av det koblede system biokatalytisk ved innkapsling av hele celler i kalsium alginatkuler. Som et eksempel presenterer vi den forbedrede biosyntesen av L-xylulose fra L-arabinitol ved kobling E. coli-celler som uttrykker enzymene L-arabinitol dehydrogenase eller NADH-oksidase. Under optimale betingelser og ved hjelp av en initial konsentrasjon på 150mM L-arabinitol, den maksimale L-xylulose utbytte nådde 96%, som er høyere enn de som er rapportert i litteraturen. Den immobiliserte formen av de sammenkoblede hel-celle biokatalysatorer vist god driftsstabilitet, opprettholde 65% av utbyttet oppnådd i den første syklusen etter 7 sykluser av påfølgende gjenbruk, mens det frie cellesystemet nesten helt mistet den katalytiske aktivitet. Derfor metodene som presenteres her, har to strategier som kan bidra til å forbedre den industrielle produksjon av L-xylose, samt andre verdiøkende forbindelser som krever bruk av kofaktorer generelt.

Introduction

Reduktiv hel-celle biotransformasjon ved hjelp av mikroorganismer er blitt en utbredt metode for chemo-enzymatisk syntese av kommersielt og terapeutisk viktige biomolekyler ^{1 – 3.} Den presenterer flere fordeler i forhold til bruken av isolerte enzymer, spesielt eliminering av kostnadskrevende nedstrøms renseprosesser, og påvisning av forlenget levetid ^{4 – 7.} For biokatalytiske veier hvor kofaktorer som er nødvendige for produktdannelse, hel-celle-systemer har potensial til å gi in situ kofaktor regenerering ved tilsetning av billige elektrondonerende ko-substrater ^5,8,9. Imidlertid er denne kapasiteten redusert for reaksjoner som krever en støkiometrisk konsentrasjon av sjeldne eller kostbare ko-substrat ^{10 – 13.} Sammen med dårlig gjenbruk av hele celler, hindrer dette etablering av en skalerbar og kontinuerlig proDette skjer system. Strategiske modifikasjoner av hel-celle-systemer for disse kofaktor-avhengige biotransformasjoner er nødvendig for å overvinne de ovennevnte begrensninger. Nærmere bestemt, er kombinasjonen av hel-celle-biokatalysatorer som samarbeider har vist seg å betydelig forbedre produktivitet og stabilitet av de næret enzymene ^14. Disse faktorene, som ofte er avgjørende for å muliggjøre storskala produksjon av kommersielt levedyktige produkter, kan optimaliseres ytterligere ved co-immobilisere biokatalytiske mikrober ^15. Vi har nylig utviklet en enkel og gjenbruk hel-celle biokatalytisk system som gjør at både kofaktor regenerering og biocatalyst immobilisering for L-xylulose produksjon ^16. I denne studien ble dette systemet brukt som et eksempel for å illustrere de eksperimentelle prosedyrer for å bruke disse to strategiene for økt biotransformasjon utbyttet og biocatalyst gjenbruk.

L-xylulose tilhører en CLAss av biologisk nyttige molekyler kalt sjeldne sukker. Sjeldne sukker er unike monosakkarider eller sukkerderivater som skjer svært sjelden i naturen, men spille viktige roller som anerkjennelse elementer i bioaktive molekyler ^17,18. De har en rekke bruksområder fra søtningsmidler, funksjonell mat til potensielle legemiddel ^19. L-xylulose kan brukes som en potensiell inhibitor av flere a-glukosidaser, og kan også brukes som en indikator for hepatitt eller skrumplever ^17,20. Høy virkningsgrad konvertering av xylitol til L-xylulose i hel-cellesystemer er blitt rapportert tidligere i Pantoea ananatis ^21,22, Alcaligenes sp. 701B ^23, Bacillus pallidus Y25 ^24,25 og Escherichia coli ^26. I E. coli, ble det imidlertid oppnådd bare ved hjelp lav (<67 mm) xylitol konsentrasjoner ²⁶ på grunn av potensielle inhiberende virkninger av en initial xylitol konsentrasjon høyere enn 100 mm på xylitol-4-dehydrogenase aktivitet ^21,26. Den termodynamiske likevekt mellom xylulose og xylitol har vist seg å sterkt favorisere dannelsen av xylitol ^25,27. I tillegg er xylulose utbytte begrenset av mengden av dyre kofaktorer som må tilføres i fravær av en in situ-kofaktor regenerering system. Sammen utgjør disse faktorene begrenser mulighetene for skalering i bærekraftige systemer for L-xylulose biosyntese.

For å overvinne disse begrensningene og forbedre L-xylulose biotransformasjon yield, var det strategiske kofaktor regenerering ansatt først ved å etablere en kombinert hel-celle biokatalytisk system. Nærmere bestemt, L-arabinitol 4-dehydrogenase (EC 1.1.1.12) fra Hypocrea jecorina (HjLAD), et enzym som er i L-arabinose katabolismen av sopp, ble valgt for å katalysere omdannelsen av L-arabinitol inn i L-xylulose ^28,29 . Som mange biosyntetiske enzymer, en stor limitation HjLAD er at det krever en støkiometrisk mengde av den kostbare nikotinamidadenindinukleotid kofaktor (NAD ^+, den oksyderte form av NADH) for å utføre denne omdannelsen. NADH oxidase funnet i Streptococcus pyogenes (SpNox) har vist seg å vise høy kofaktor-regenerering aktivitet ^30,31. Benytte seg av denne egenskap av SpNox, E. coli-celler som uttrykker HjLAD for fremstilling av L-xylulose ble koblet med E. coli-celler som uttrykker SpNox for regenereringen av NAD ⁺ for å øke den L-xylulose produksjon avbildet ved den koblede reaksjonen vist i Figur 1A. Under optimale forhold og ved hjelp av en initial konsentrasjon på 150 mM L-arabinitol, den maksimale L-xylulose utbytte nådde 96%, noe som gjør dette system mye mer effektiv enn de som er rapportert i litteraturen.

Strategien for hel-celle immobilisering ble ansatt ved ytterligere styrke gjenbruk av kombinert biocatalytic system. Vanlig brukte metoder for hel-celle immobilisering inkluderer adsorpsjon / kovalent kobling til faste matriser, kryssbinding / entrapment og innkapsling i polymere nettverk ^32. Blant disse metodene, er den mest egnede metode for celle immobilisering er innkapsling i kalsium alginatkuler. Deres milde gel-egenskapene, inert vandig matrise og høy porøsitet bidra til å bevare de fysiologiske egenskaper og funksjonalitet av de innkapslede biologiske ^33. Derfor er koplet biokatalysator system inneholdende både E. coli-celler som HjLAD eller SpNox ble immobilisert på kalsium alginat perler til å aktivere flere sykluser av L-xylulose produksjon (figur 2) sikret immobilisert biocatalyst systemet demonstrert god driftsstabilitet, opprettholde 65% av konverterings utbyttet av den første syklusen etter 7 runder med påfølgende gjenbruk, mens den frie cellesystemet nesten helt mistet sin katalytiske aktivitet.

Protocol

1. Hel-celle Biocatalysts Forberedelse MERK: rekombinant E. coli-celler som pET28a- SpNox 31 eller pET28a- HjLAD 28 blir heretter referert til som E. coli SpNox og E. coli HjLAD hhv. Vaksinere en enkelt koloni av E. coli HjLAD i 3 ml Luria-Bertani (LB) medium supplementert med kanamycin (50 ug / ml) og inkuberes i en risteinkubator O / N ved 37 ° C, 250 rpm. Forty…

Representative Results

For å aktivere kofaktor regenerering, ble L-xylulose-syntese utført i en koplet hel-celle biokatalytisk system inneholdende E. coli HjLAD og E. coli SpNox celler. Etter optimaliseringen av forskjellige parametere, ble gjenbruk av dette systemet forbedres ved å immobilisere den i kalsium alginatkuler (figur 2). L-xylulose produksjon med kofakt…

Discussion

Nyere teknologiske fremskritt har aktivert en bølge i kommersialisering av rekombinante biotherapeutics, noe som resulterer i en gradvis økning i markedsverdi i bioteknologisk industri. En slik utvikling er det advent av metabolsk ingeniør i rekombinante mikroorganismer, som har vist et stort løfte i å etablere skalerbare industrielle systemer ^38. Som med de fleste prosesser, er det en vellykket kommersialisering av rekombinante biomolekyler som er produsert av genetisk modifiserte mikroorganismer svært…

Materials

LB broth	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Sodium alginate	Sigma Aldrich	W201502
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 shaker incubator	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Beakers	Fisher
Syringe	Fisher
Needle	Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance	Ohaus