تجميد البيولوجية الحفازة متعدد في الخرز الجيني للالعامل المساعد تجديد وتحسين إعادة استخدام

Summary

قدم هو بروتوكول شارك مستوقف البيولوجية الحفازة خلية كاملة لتجديد العامل المساعد وتحسين إعادة استخدام، وذلك باستخدام إنتاج L-زايلولوز كمثال على ذلك. ويتحقق تجديد العامل المساعد من قبل اقتران سلالتين القولونية التعبير عن الانزيمات التكميلية وظيفيا. حقق المتحفز الحيوي تجميد كامل الخلية التي كتبها تغليف الخلايا في حبات الجينات الكالسيوم.

Abstract

لقد وضعت مؤخرا نظام biocatalytic خلية كاملة بسيطة، قابلة لإعادة الاستخدام وإلى جانب القدرة على تجديد العامل المساعد والشلل المتحفز الحيوي لتحسين العائد إنتاج وتركيب المستدام. طيه وصفها هو الإجراء التجريبي لتطوير مثل هذا النظام تتكون من اثنين من E. سلالات كولاي التي تعبر عن الإنزيمات التكميلية وظيفيا. معا، ويمكن لهذه الانزيمات اثنين تعمل بصورة تعاونية للتوسط في تجديد العوامل المساعدة مكلفة لتحسين المحصول المنتج من bioreaction. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن طريقة تجميع شكل يجمد النظام biocatalytic مقرونة تغليف الخلايا بأكملها في حبات الجينات الكالسيوم. وكمثال على ذلك، نقدم الحيوي محسنة من L-زايلولوز من L-arabinitol بواسطة اقتران E. خلايا القولونية التعبير عن الانزيمات L-arabinitol نازعة أو أوكسيديز NADH. تحت الظروف المثلى وباستخدام تركيز الأولي من 150ملي L-arabinitol، بلغ الأقصى-L زايلولوز العائد 96٪، وهي نسبة أعلى من تلك التي ذكرت في الأدبيات. أظهر شكل يجمد لالبيولوجية الحفازة خلية كاملة إلى جانب الاستقرار التشغيلي الجيد، والحفاظ على 65٪ من المحصول تم الحصول عليها في الدورة الأولى بعد 7 دورات إعادة استخدامها على التوالي، في حين أن النظام الخليوي حرة فقدت تماما تقريبا النشاط التحفيزي. ولذلك، فإن وسائل ذكرت هنا توفر اثنين من الاستراتيجيات التي يمكن أن تساعد على تحسين الإنتاج الصناعي من L-زايلولوز، فضلا عن غيرها من المركبات ذات القيمة المضافة التي تتطلب استخدام العوامل المساعدة بشكل عام.

Introduction

أصبح التخفيض خلية كاملة أحيائي باستخدام الكائنات الدقيقة طريقة على نطاق واسع لتركيب الكيماوي الأنزيمية من الجزيئات الحيوية الهامة تجاريا وعلاجيا ^1-3. وهو يقدم العديد من المزايا على استخدام الإنزيمات المعزولة، وخاصة القضاء على عمليات تنقية المصب مكثفة من حيث التكلفة ومظاهرة من العمر الممتد ^4-7. لمسارات biocatalytic حيث يطلب من العوامل المساعدة لتشكيل المنتجات والنظم خلية كاملة لديها القدرة على توفير في الموقع العامل المساعد تجديد عن طريق إضافة غير مكلفة-التبرع الإلكترون المشارك ركائز ^5،8،9. ومع ذلك، تتقلص هذه القدرة على ردود الفعل التي تتطلب تركيز متكافئة النادرة أو باهظة الثمن المشارك ركائز ^10-13. جنبا إلى جنب مع إعادة استخدام الفقيرة من الخلايا الكاملة، وهذا يعوق إنشاء الم Ù تحجيم ومستمرنظام ction. مطلوبة التعديلات الاستراتيجية لنظم خلية كاملة لهذه التحولات الحيوية التي تعتمد على العامل المساعد للتغلب على القيود المذكورة أعلاه. على وجه التحديد، وقد ثبت أن الجمع بين البيولوجية الحفازة خلية كاملة تعمل بشكل تعاوني ليعزز إلى حد كبير الإنتاجية وثبات إنزيمات آوى ^14. هذه العوامل، التي غالبا ما تكون حاسمة لتمكين الإنتاج على نطاق واسع من المنتجات مجدية تجاريا، يمكن زيادة الأمثل كل شل حركة المشارك الميكروبات biocatalytic ^15. لقد وضعت مؤخرا خلية كاملة نظام biocatalytic بسيطة وقابلة لإعادة الاستخدام التي تسمح لكل تجديد العامل المساعد والشلل المتحفز الحيوي لل-L زايلولوز إنتاج ^16. في هذه الدراسة، تم استخدام هذا النظام كمثال لتوضيح الإجراءات التجريبية من تطبيق هذه الاستراتيجيات اثنين لتحسين العائد إنتاج أحيائي وإعادة استخدام المتحفز الحيوي.

L-زايلولوز ينتمي إلى القانون المدنيSS من الجزيئات المفيدة بيولوجيا يدعى السكريات نادرة. السكريات الأحادية هي نادرة فريدة من نوعها أو مشتقات السكر الذي يحدث نادرا جدا في الطبيعة، ولكن تلعب أدوارا حاسمة كعناصر الاعتراف في الجزيئات النشطة بيولوجيا ^17،18. لديهم مجموعة متنوعة من التطبيقات بدءا من المحليات، والأغذية الوظيفية إلى العلاجات المحتملة ^19. L-زايلولوز يمكن استخدامها كمانع المحتمل لعدة α-غلوكوسيديزات، ويمكن أيضا أن تستخدم كمؤشر على التهاب الكبد أو الكبد تليف الكبد ^17،20. تم الإبلاغ عن تحويل كفاءة عالية من إكسيليتول إلى L-زايلولوز في أنظمة خلية كاملة سابقا في Pantoea ananatis ^21،22، المقلونة ليرة سورية. 701B ^23، عصيات الشاحبة Y25 ^24،25 والقولونية ^26. في E. القولونية، ومع ذلك، لم يتحقق إلا باستخدام منخفضة (<67 مم) تركيزات إكسيليتول ²⁶ بسبب الآثار المثبطة المحتملة لتركيز إكسيليتول الأولي أعلى من 100 ملم على النشاط إكسيليتول-4-نازعة ^21،26. وقد تبين التوازن الحرارية بين زايلولوز وإكسيليتول لصالح بشدة تشكيل إكسيليتول ^25،27. بالإضافة إلى ذلك، العائد زايلولوز محدودة بمقدار العوامل المساعدة باهظة الثمن التي لا بد من توفيرها في ظل عدم وجود نظام في الموقع العامل المساعد تجديد. معا، هذه العوامل تحد من إمكانية التوسع في نظم مستدامة لالحيوي-L زايلولوز.

للتغلب على هذه القيود وتحسين العائد أحيائي-L زايلولوز، كان يعمل استراتيجية تجديد العامل المساعد أول من وضع نظام biocatalytic خلية كاملة إلى جانب. على وجه التحديد، L-Arabinitol 4 نازعة (EC 1.1.1.12) من فطر المستلحمة jecorina (HjLAD)، وهو الانزيم في مسار-L الارابينوز تقويضي من الفطريات تم اختيار، لتحفيز تحويل L-arabinitol إلى L-زايلولوز ^28،29 . مثل العديد من الإنزيمات السكروز، وهو limitatio كبيرن من HjLAD هو أنه يتطلب كمية متكافئة من تكلفة نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد العامل المساعد (NAD ^+، وشكل المؤكسد من NADH) لتنفيذ هذا التحويل. وقد تبين NADH أوكسيديز وجدت في العقدية المقيحة (SpNox) لعرض النشاط المرتفع العامل المساعد-تجديد ^30،31. الاستفادة من هذه السمة من SpNox، E. اقترنت خلايا القولونية التعبير عن HjLAD لإنتاج L-زايلولوز مع E. خلايا القولونية التعبير عن SpNox للتجديد من NAD ⁺ إلى زيادة إنتاج-L زايلولوز يصور رد فعل يقترن هو مبين في الشكل 1A. تحت الظروف المثلى وباستخدام تركيز الأولي من 150 ملي L-arabinitol، بلغ الأقصى-L زايلولوز العائد 96٪، مما يجعل هذا النظام أكثر كفاءة بكثير من تلك التي ذكرت في الأدب.

كان يعمل استراتيجية تجميد خلية كاملة بجانب زيادة تعزيز إعادة استخدام من جانب biocatalytنظام جيم. وتشمل الأساليب المستخدمة عادة لتجميد كامل الخلية الامتزاز / التساهمية ربط المصفوفات الصلبة، عبر ربط / انحباس والتغليف في شبكات البوليمرية ^(32). ومن بين هذه الأساليب، الأسلوب الأكثر مناسبة لتجميد الخلية التغليف في حبات الجينات الكالسيوم. خصائصها دبق خفيفة، مصفوفة المائية الخاملة والمسامية العالية تساعد في الحفاظ على الخصائص الفسيولوجية وظائف البيولوجية مغلفة ^33. ولذلك، فإن نظام المتحفز الحيوي إلى جانب تحتوي على كل من E. وقد ثبتوا الخلايا القولونية إيواء HjLAD أو SpNox في حبات الجينات الكالسيوم لتمكين دورات متعددة من الإنتاج L زايلولوز (الشكل 2). وأظهر نظام المتحفز الحيوي يجمد الاستقرار التشغيلي الجيد، والحفاظ على 65٪ من العائد تحويل الدورة الأولى بعد 7 دورات إعادة استخدامها على التوالي، في حين أن النظام الخليوي حرة فقدت تماما تقريبا النشاط التحفيزي.

Protocol

1. كامل الخلية البيولوجية الحفازة التحضير ملاحظة: المؤتلف E. خلايا القولونية إيواء pET28a- SpNox 31 أو pET28a- HjLAD 28 والمشار إليها فيما E. القولونية E. SpNox و القولونية HjLAD، على التوالي. <ol style=";…

Representative Results

لتمكين تجديد العامل المساعد، وجرى تركيب-L زايلولوز في نظام biocatalytic خلية كاملة إلى جانب تحتوي على E. القولونية E. HjLAD و خلايا القولونية SpNox. بعد الأمثل لمختلف المعلمات، وتحسين إعادة استخدام هذا النظام عن طريق شل حركة ?…

Discussion

وقد مكنت التطورات التكنولوجية الأخيرة طفرة في تسويق biotherapeutics المؤتلف، مما أدى إلى ارتفاع تدريجي في قيمتها السوقية في صناعة التكنولوجيا الحيوية. واحدة هذا التطور هو ظهور الهندسة الأيضية في الكائنات الحية الدقيقة المؤتلف، التي أظهرت وعدا كبيرا في تأسيس النظم الصناعي…

Materials

LB broth	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Sodium alginate	Sigma Aldrich	W201502
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 shaker incubator	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Beakers	Fisher
Syringe	Fisher
Needle	Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance	Ohaus