Immobilisering av Multi-biokatalysatorer i alginatpärlor för Cofactor Regeneration och förbättrad Återanvändning

Summary

Presenteras är protokollet för co-immobilisera hela celler biokatalysatorer för kofaktor förnyelse och förbättrad återanvändbarhet, med hjälp av produktionen av L-xylulos som ett exempel. Kofaktorn regenere uppnås genom att koppla två Escherichia coli-stammar som uttrycker funktionellt kompletterande enzymer; helcell-biokatalysator immobilisering åstadkommes genom cellinkapsling på kalcium alginatpärlor.

Abstract

Vi har nyligen utvecklat en enkel, återanvändbar och kopplade helcells-biokatalytisk system med förmågan att kofaktor förnyelse och biokatalysator immobilisering för förbättrad produktionsutbyte och ihållande syntes. Beskrivs härmed är den experimentella proceduren för utvecklingen av ett sådant system som består av två E. coli-stammar som uttrycker funktionellt kompletterande enzymer. Tillsammans kan dessa två enzymer fungera kooperativt att mediera regenerering av dyra kofaktörer för att förbättra produktutbyte av den Bioreaktionsteknik. Dessutom är metoden för syntetisering av en immobiliserad form av det kopplade biokatalytisk systemet genom inkapsling av hela celler i kalcium alginatpärlor rapporterats. Som ett exempel presenterar vi den förbättrade biosyntesen av L-xylulos från L-arabinitol genom koppling E. coli-celler som uttrycker enzymerna L-arabinitoldehydrogenas eller NADPH-oxidas. Under optimala förhållanden och med användning av en initial koncentration av 150mM L-arabinitol, nådde den maximala L-xylulos utbyte 96%, vilket är högre än de som rapporterats i litteraturen. Den immobiliserade formen av de kopplade helcells-biokatalysatorer visade god driftstabilitet, bibehålla 65% av avkastningen som erhålls i den första cykeln efter 7 cykler av successiv återanvändning, medan den fria cellsystemet nästan helt förlorat den katalytiska aktiviteten. Därför metoder rapporterade här ger två strategier som kan bidra till att förbättra den industriella produktionen av L-xylulos, liksom andra mervärdes föreningar kräver användning av kofaktorer i allmänhet.

Introduction

Reduktiv helcells-biotransformation med hjälp av mikroorganismer har blivit en utbredd metod för kemo-enzymatisk syntes av kommersiellt och terapeutiskt viktiga biomolekyler ^{1 – 3.} Den presenterar flera fördelar jämfört med användning av isolerade enzymer, särskilt avskaffandet av kostnadsintensiva nedströms reningsprocesser och demonstration av en förlängd livslängd ^4-7. För biokatalytiska vägar där det krävs kofaktörer för produktbildning, hela-cellsystem har potential att ge in situ kofaktor förnyelse via tillsats av billiga elektrondone samsubstrat ^5,8,9. Emellertid är denna kapacitet minskas för reaktioner som kräver en stökiometrisk koncentration av sällsynta eller dyra samsubstrat ^{10 – 13.} Tillsammans med dålig återanvändning av hela celler, hindrar detta inrättandet av en skalbar och kontinuerlig produInsatser systemet. Strategiska modifieringar av hel-cellsystem för dessa kofaktor beroende biotransformationer krävs för att övervinna ovannämnda begränsningar. Specifikt har kombinationen av hela celler biokatalysatorer som arbetar kooperativt visat sig signifikant öka produktiviteten och stabiliteten av de hyste enzymerna ^14. Dessa faktorer, som ofta kritisk för att möjliggöra storskalig produktion av kommersiellt gångbara produkter, kan optimeras ytterligare genom samtidig immobilisering biokatalytiska mikrober ^15. Vi har nyligen utvecklat en enkel och återanvändbar hel-cell biokatalytisk system som tillåter både kofaktor förnyelse och biokatalysator immobilisering för L-xylulos produktion ^16. I denna studie var detta system som används som ett exempel för att illustrera de experimentella förfarandena för att tillämpa dessa två strategier för förbättrad biotransformation produktionsutbyte och biokatalysator återanvändbarhet.

L-xylulos tillhör en class av biologiskt användbara molekyler som heter sällsynta sockerarter. Sällsynta sockerarter är unika monosackarider eller sockerderivat som förekommer mycket sällan i naturen, men spelar viktiga roller som igenkänningselement i bioaktiva molekyler ^17,18. De har en mängd olika tillämpningar som sträcker sig från sötningsmedel, funktionella livsmedel för potentiella terapeutiska medel ^19. L-xylulos kan användas som en potentiell inhibitor av flera a-glukosidaser, och kan också användas som en indikator på hepatit eller levercirros ^17,20. Hög omvandlingseffektivitet av xylitol till L-xylulos i hel-cellsystem har tidigare rapporterats i Pantoea ananatis ^21,22, Alcaligenes sp. 701B ^23, Bacillus pallidus Y25 ^24,25 och Escherichia coli ^26. I E. coli, men det var endast uppnås med hjälp av låga (<67 mm) xylitolkoncentrationerna ²⁶ på grund av potentiella inhibitoriska effekterna av en initial xylitol koncentration högre än 100 mM om xylitol-4-dehydrogenas aktivitet ^21,26. Termodynamisk jämvikt mellan xylulos och xylitol har visat sig starkt gynna bildandet av xylitol ^25,27. Dessutom är xylulos avkastning begränsas av mängden av dyra kofaktorer som måste levereras i frånvaro av en in situ kofaktor regenereringssystem. Tillsammans utgör dessa faktorer begränsar risken för skalning i hållbara system för L-xylulos biosyntesen.

För att övervinna dessa begränsningar och förbättra L-xylulos biotransformation avkastning, var strategin att kofaktor regenere anställd först genom att upprätta en kopplad helcells-biokatalytisk systemet. Specifikt, L-arabinitol 4-dehydrogenas (EC 1.1.1.12) från svampdynor jecorina (HjLAD), ett enzym i L-arabinos katabolism av svampar, valdes för att katalysera omvandlingen av L-arabinitol till L-xylulos ^28,29 . Liksom många biosyntetiska enzymer, en stor limitation HjLAD är att det kräver en stökiometrisk mängd av den dyra nikotinamidadenindinukleotid cofaktor (NAD ^+, den oxiderade formen av NADH) för att genomföra denna omvandling. NADPH-oxidas hittades i Streptococcus pyogenes (SpNox) har visat att visa hög kofaktor-regenereringsaktivitet ^30,31. Med utnyttjande av detta attribut av SpNox, E. coli-celler som uttrycker HjLAD för produktion av L-xylulos kopplades med E. coli-celler som uttrycker SpNox för regenerering av NAD ^{+ för} att öka L-xylulos produktion avbildas av den kopplade reaktionen som visas i figur 1A. Under optimala förhållanden och med användning av en initial koncentration av 150 mM L-arabinitol, nådde den maximala L-xylulos utbyte 96%, vilket gör detta system mycket mer effektiv än de som rapporteras i litteraturen.

Strategin med helcells-immobilisering användes nästa för att ytterligare förbättra återanvändbarheten för den kopplade biocatalytIC-systemet. Vanligen använda metoder för helcells-immobilisering inkluderar adsorption / kovalent länkning till fasta matriser, tvärbindning / infångning och inkapsling i polymera nätverk ^32. Bland dessa metoder är den lämpligaste metoden för cell immobilisering inkapsling i kalcium alginatpärlor. Deras milda gelningsegenskaper, inert vattenmatris och hög porositet hjälpa till att bevara de fysiologiska egenskaper och funktioner hos de inkapslade biologiska ^33. Därför den kopplade biokatalysatorn system innehållande både E. coli-celler som hyser HjLAD eller SpNox immobiliserades i kalciumalginat pärlor för att möjliggöra flera cykler av L-xylulos (figur 2) .Den immobiliserade biokatalysator-system visade god driftstabilitet, bibehålla 65% av omvandlingsutbytet av den första cykeln efter 7 cykler av successiv återanvändning, medan den fria cellsystemet nästan helt förlorat sin katalytiska aktivitet.

Protocol

1. Hela-cell Biokatalysatorer Förberedelse OBS: Den rekombinanta E. coli-celler som hyser pET28a- SpNox 31 eller pET28a- HjLAD 28 är följande kallad E. coli SpNox och E. coli HjLAD, respektive. Ympa en enda koloni av E. coli HjLAD i 3 ml Luria-Bertani (LB) medium med tillsats av kanamycin (50 | ig / ml) och inkubera i en inkubator-skakapparat O / N vid 37 ° C, 250 rpm. <…

Representative Results

Att möjliggöra kofaktor regenerering, var L-xylulos syntes utförs i en kopplad helcells-biokatalytisk system innehållande E. coli HjLAD och E. coli SpNox celler. Efter optimering av olika parametrar, var återanvändbarhet av detta system förbättras genom att immobilisera det på kalcium alginatpärlor (Figur 2). L-xylulos Produktion med C…

Discussion

Nya tekniska framsteg har gjort det möjligt ett uppsving i kommersialiseringen av rekombinanta proteinläkemedel, vilket resulterar i en gradvis ökning av marknadsvärdet inom bioteknikindustrin. En sådan utveckling är uppkomsten av metabolisk teknik i rekombinanta mikroorganismer, som har visat en mycket lovande i upprättandet skalindustrisystem ^38. Som med de flesta processer är framgångsrik kommersialisering av rekombinanta biomolekyler som produceras av genetiskt modifierade mikrober starkt beroend…

Materials

LB broth	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Sodium alginate	Sigma Aldrich	W201502
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 shaker incubator	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Beakers	Fisher
Syringe	Fisher
Needle	Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance	Ohaus