Isolement et caractérisation d'une tête et du cou squameux Carcinome Sous-population Ayant les cellules souches Caractéristiques

Summary

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Abstract

Malgré les progrès dans la compréhension de la tête et du cou carcinomes épidermoïdes (CETC) progression, le taux de survie à cinq ans reste faible en raison de la récidive locale et des métastases à distance. Une hypothèse pour expliquer cette récurrence est la présence de cellules souches comme le cancer (CCM) qui présentent une chimio- inhérente et radio-résistance. Afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire d'avoir des modèles expérimentaux qui valident l'efficacité des traitements ciblés et donc de disposer de méthodes fiables pour l'identification et l'isolement des CSC. A cette fin, nous présentons un protocole pour l'isolement des cellules souches cancéreuses à partir de lignées cellulaires humaines HNSCC qui repose sur la combinaison de deux tries successives de cellules réalisées par cellules activées par fluorescence (FACS). La première est basée sur la propriété de CSCs à surexpriment ATP-Binding Cassette (ABC) protéines de transport et donc exclure, entre autres, des colorants d'ADN vitaux tels que Hoechst 33342. Les cellules triées avec eest la méthode sont identifiés comme une «population de côté» (SP). Étant donné que les cellules SP représentent un pourcentage faible (<5%) des cellules parentales, une phase de croissance est nécessaire afin d'augmenter leur nombre avant le second tri cellulaire. L'étape suivante permet la sélection des cellules qui possèdent deux autres caractéristiques de cellules souches de CETC -à- dire de haut niveau du marqueur de surface cellulaire CD44 (CD44 ^haute) et la surexpression de l' aldéhyde déshydrogénase (ALDH ^haute) expression. Depuis l'utilisation d'un marqueur unique a de nombreuses limites et les pièges pour l'isolement des cellules souches cancéreuses, la combinaison de SP, CD44 et des marqueurs de l'ALDH fournira un outil utile pour isoler CSCs pour d'autres essais analytiques et fonctionnelles nécessitant des cellules viables. Les caractéristiques de souches comme des cellules souches cancéreuses a finalement été validés in vitro par la formation de tumorispheres et l'expression de β-caténine.

Introduction

Tête et cou épidermoïde carcinome (CETC) est une tumeur maligne commune dans le monde entier et malgré les progrès réalisés dans les traitements actuels, les patients ayant une maladie avancée ont un mauvais pronostic. Le taux de survie à 5 ans globale du patient est d'environ 30%, malgré la combinaison d'approches thérapeutiques, y compris la chirurgie, chimio-radiothérapie et-thérapies ciblées. Des études récentes attribuent une récidive locale et de métastases à distance à la survie des cellules souches comme le cancer (CSC) suivant des thérapies anticancéreuses ^1. Il y a accumulation de preuves étayant l'existence de cellules présentant des cellules souches propriétés (capacités état ​​indifférencié, auto-renouvellement et de différenciation, et l' activité de la télomérase) dans diverses tumeurs solides , y compris du sein, du cerveau, de la prostate, du poumon, du côlon, du pancréas, du foie et de la peau ^{2- 10.} Cependant, l'origine de CSCs reste incertaine ^11,12. Ils peuvent résulter de la transformation maligne des cellules souches normales ^3,13 ou dedifferenciation des cellules tumorales qui acquièrent des caractéristiques telles que ^CCM-14,15. Par conséquent, la compréhension des voies distinctes relatives à CSCs permettra de mieux comprendre le diagnostic et le traitement des CETC résistant tôt.

Il a été proposé que les cellules souches cancéreuses possèdent également des phénotypes résistants qui soustraient chimiothérapie et la radiothérapie classique, ce qui entraîne une rechute de la tumeur par rapport à la masse des cellules tumorales et ^16-19 sont localisées dans des niches ²⁰ hypoxique. De nombreux facteurs ont été proposés pour expliquer ces résistances de CSCS, tels que la propension à quiescence, amélioré la réparation de l' ADN, des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire régulés à la hausse, et de balayage des radicaux libres ^21. En outre, plusieurs voies moléculaires oncogéniques peuvent être spécifiquement activées dans CSCs ^17. Afin d'améliorer la connaissance des CSC pour-thérapies ciblées en outre, nous avons besoin de méthodes fiables pour l'identification et l'isolement des CSCs, en raison de l'hétérogénéité des marqueurs liés à des cellules souches dansdivers types de cancers ^22.

En CETC, cellules souches , initiatrices de tumeurs ont été isolées à partir de tumeurs de patients primaire par le tri des cellules exprimant différents biomarqueurs du SCC (tels que la drogue efflux transporteurs expression ^23, CD44 ^élevé, CD24 ^faible CD133 ^élevé, c-Met ⁺ phénotype ^{10,24, 25,} ou ALDH ^haute activité ²⁶⁾ ou la culture de la tumeur primaire du patient pour former squamospheres qui ont des propriétés du SCC. Néanmoins, le nombre de squamospheres diminue considérablement après deux passages, donnant ainsi une petite taille de l' échantillon pour une caractérisation des études ^27. Par conséquent, des essais in vitro à partir de lignées cellulaires bien établies est une solution plus facile à concevoir des expériences en vue d'améliorer la connaissance des CSC.

Le but de cet article est de proposer une méthode pour isoler CSCs de lignées de cellules HNSCC utilisant cytométrie de flux multiparamétrique analyse unnd tri cellulaire. L'expression de CD44 en corrélation avec plusieurs propriétés CCM y compris l'activité de ALDH, Side Population (SP) phénotype, la capacité de formation sphéroïde et tumorigénicité sont utilisés pour isoler et caractériser cette sous-population de CSCs. CD44 est une glycoprotéine de surface cellulaire, est impliquée dans l'adhésion cellulaire et la migration. CD44 est fortement exprimé dans de nombreuses tumeurs solides CSCs ^28, y compris dans la tête et le cancer du col modèles ^29-31. De plus, les cellules CD44 ^élevées peuvent générer in vivo d' une tumeur hétérogène alors que les cellules CD44 ^faibles ne peuvent pas ^10. Le dosage de PS est basé sur le potentiel différentiel des cellules à efflux le colorant Hoechst ²² par l' intermédiaire de la famille ATP-binding cassette (ABC) , des protéines de transport surexprimés dans la membrane du SCC. Ce dosage comprend l'utilisation d'inhibiteurs de transporteurs ABC tels que le vérapamil dans les échantillons témoins. Aldéhyde déshydrogénase (ALDH) est une enzyme intracellulaire qui est impliqué dans la conversion du rétinol à retl' acide inoic lors de la différenciation des cellules souches début ^25,26. Les cellules qui présentent une forte activité ALDH montrent le comportement des cellules souches comme dans HNSCC ²⁶ et un très petit nombre de cellules ^élevées ALDH sont capables de générer des tumeurs in vivo ^26,32.

La combinaison de ces marqueurs et des propriétés a été utilisé avec succès par Bertrand e t al. , Pour étudier la résistance in vitro et in vivo de ces cellules souches cancéreuses à un rayonnement de photons et ¹⁹ ions carbone. Leurs résultats ont clairement montré que la combinaison de différents marqueurs cellulaires et propriétés sont plus sélectifs pour les études utiles sur les populations HNSCC CCM que les approches mono-marqueurs.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives locales sur les soins aux animaux. Tous les détails de cette étude ont été approuvés par le CECCAPP, un comité d'éthique français. 1. La sélection d'une population latérale (SP) par le colorant Hoechst efflux Dosage Coloration 50 millions de cellules avec le colorant Hoechst 33342. Préparer deux 15 ml dans des tubes stériles à fond conique: un tube marqué "HOECHST" et une …

Representative Results

L'isolement des CSCs de lignées de cellules HNSCC requis deux tris successifs en raison de la très faible pourcentage de CSCs dans la lignée cellulaire parentale. Le premier tri est basé sur la capacité des cellules souches cancéreuses à exclure le colorant Hoechst du fait de transporteurs à efflux. Cela a abouti à l' acquisition de 1-5% de la population totale des cellules triées (figure 1). Au cours du colorant Hoechst cellulaire négative tri, vérif…

Discussion

Ce protocole décrit une méthode fiable pour l'isolement réussi de cellules souches cancéreuses à partir d'une lignée cellulaire spécifique qui est applicable à d'autres lignées de cellules HNSCC. Tête et du cou CSCs isolés sont ensuite appropriés pour une caractérisation moléculaire in vitro et la validation fonctionnelle par la transplantation chez des souris immunodéficientes ^19. Cependant, certaines modifications peuvent être testés en fonction de la population de côt…

Materials

Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Heparin	StemcellTM Technologies	7980
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
Verapamil hydrochloride	Sigma-Aldrich	V-4629	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
ALDEFLUOR Kit	Stem Cell	1700
CD44-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	–
FaDu cell line	ATCC	HTB-43
Low anchorage plates	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDiva software v8.0.1	BD Biosciences	–