Isolering og karakterisering av et hode og hals plateepitelkarsinom undergruppe ha stamcelle Kjennetegn

Summary

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Abstract

Til tross for fremskritt i forståelsen av hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) progresjon, forblir fem års overlevelse lav på grunn av lokale tilbakefall og fjernmetastaser. En hypotese for å forklare dette gjentakelse er tilstedeværelse av kreft stilk-lignende celler (cscs) som presenterer iboende kjemo- og radio-motstand. For å kunne utvikle nye terapeutiske strategier, er det nødvendig å ha eksperimentelle modeller som validerer effektiviteten av målrettet behandling, og derfor for å ha pålitelige fremgangsmåter for identifisering og isolering av cscs. For å oppnå dette, presenterer vi en protokoll for isolering av cscs fra humane HNSCC-cellelinjer som er avhengig av kombinasjonen av to suksessive cellesorteringer som utføres av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Den første er basert på eiendommen til cscs å overuttrykke ATP-bindende kassett (ABC) transportørproteiner og dermed ekskludere, blant annet viktige DNA-fargestoffer som Hoechst 33342. Cellene sortert med ther fremgangsmåten er identifisert som en "side populasjon" (SP). Som SP-cellene representerer en lav andel (<5%) av parentale celler, er det nødvendig med en vekstfase for å øke deres antall før den andre cellesortering. Det neste trinnet gjør det mulig for utvelgelse av celler som besitter to andre HNSCC stamcelle egenskaper, dvs. høy ekspresjon nivå av celleoverflatemarkør CD44 (CD44 ^høy) og over-ekspresjon av aldehyddehydrogenase (ALDH ^høy). Siden bruk av en enkelt markør har en rekke begrensninger og fallgruver for isolering av cscs, kombinasjonen av SP, blir CD44 og ALDH markører tilveiebringe et nyttig verktøy for å isolere cscs for videre analyse og funksjonelle analyser som krever levedyktige celler. Stammen aktige egenskaper ved cscs ble endelig validert in vitro med dannelsen av tumorispheres og ekspresjonen av β-catenin.

Introduction

Hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er en vanlig kreft over hele verden og til tross for fremgang i dagens behandling, pasienter med avansert sykdom har en dårlig prognose. Den samlede fem års overlevelse av pasienten er rundt 30% til tross for en kombinasjon av terapeutiske tilnærminger inkludert kirurgi, cellegift eller strålebehandling og målrettede-terapi. Nyere studier attributt lokalt tilbakefall og fjernmetastaser til overlevelse av kreft stamceller lignende celler (cscs) etter kreft terapier ^1. Det er vist som støtter eksistensen av celler som presenterer stamceller egenskaper (udifferensiert status, selvfornyelse og differensiering kapasiteter, og telomerase aktivitet) i ulike solide tumorer inkludert bryst, hjerne, prostata, lunge, tykktarm, bukspyttkjertel, lever og hud ^{2- 10.} Men opprinnelsen til cscs fortsatt uklart ^11,12. De kan oppstå ved malign transformasjon av normale stamceller ^3,13 eller dedifferenfor handling av kreftceller som kjøper cscs-lignende funksjoner ^14,15. Derfor vil forstå karakteristiske veier relatert til cscs gi innsikt i tidlig diagnose og behandling av resistent HNSCC.

Det har blitt foreslått at cscs også ha resistente fenotyper som unndrar standard kjemoterapi og strålebehandling, noe som resulterer i tumor tilbakefall i forhold til hoveddelen av tumorceller ^16-19 og er lokalisert i hypoksisk nisjer ^20. Mange faktorer har blitt foreslått for å forklare disse motstander cscs, for eksempel tilbøyelighet til quiescence, økt DNA reparasjon, oppregulert cellesyklus kontrollmekanismer, og frie radikaler, dvs ^21. Videre kan flere onkogene molekylære reaksjonsveier være spesielt aktiveres i cscs ^17. For å bedre kunnskapen om cscs for videre målrettet-terapi, trenger vi pålitelige metoder for identifisering og isolering av cscs, på grunn av heterogenitet av stamcellerelaterte markører iulike typer av kreft ^22.

I HNSCC, stem-lignende tumor initiere celler har blitt isolert fra primærpasient tumorer ved å sortere celler som uttrykker forskjellige CSC biomarkører (for eksempel medikament-utløps transportører uttrykk ^23, CD44 ^høy, CD24 ^lav CD133 ^høy, c-Met ⁺ fenotype ^{10,24, 25,} eller ALDH ^høy aktivitet ²⁶⁾ eller dyrke primær pasient svulst å danne squamospheres som har CSC egenskaper. Likevel antall squamospheres reduseres dramatisk etter to passeringer, og dermed gi en liten sample size for videre karakterisering studerer ^27. Derfor in vitro prøver å starte fra etablerte cellelinjer er en enklere løsning for å designe eksperimenter for å forbedre kunnskap om cscs.

Målet med denne artikkelen er å foreslå en metode for å isolere cscs fra HNSCC cellelinjer ved hjelp multiparametric flowcytometrisk analyse ennd celle sortering. Uttrykket av CD44 i sammenheng med flere cscs egenskaper, inkludert ALDH aktivitet, er Side Befolkning (SP) fenotype, spheroid formasjon evne og tumorigenicity brukes til å isolere og karakterisere dette sub-populasjon av cscs. CD44, et celleoverflate-glykoprotein, er involvert i celle adhesjon og migrering. CD44 er sterkt uttrykt i mange solide tumorer cscs ^28, blant annet i hodet og halskreft modeller ^29-31. Videre kan CD44 ^høy celler generere in vivo en heterogen tumor mens CD44 ^lav celler kan ikke ^10. SP-analysen er basert på differensialpotensialet av celler til dyseutstrømningen Hoechst fargestoff ²² via den ATP-bindende kassett (ABC) familie av transportørproteiner overuttrykt i CSC membranen. Denne analysen omfatter bruk av ABC-transportør inhibitorer slik som verapamil i kontrollprøver. Aldehyd dehydrogenase (ALDH) er en intracellulær enzym som er involvert i å konvertere retinol til retinoic syre under tidlig stamcelledifferensiering ^25,26. Celler som viser høy ALDH aktivitet showet stilk-lignende celle atferd i HNSCC ²⁶ og en svært få antall ALDH ^høye cellene er i stand til å generere tumorer in vivo ^26,32.

Kombinasjonen av disse markører og egenskapene ble med hell brukt ved Bertrand e t al., For å studere den motstand in vitro og in vivo av disse cscs til foton og karbon ion stråling ^19. Resultatene viste klart at kombinasjonen av forskjellige cellemarkører og egenskaper er mer selektive for praktiske studier på HNSCC cscs populasjoner enn enkeltmarkør tilnærminger.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til lokale retningslinjer for dyr omsorg. Alle detaljene i denne studien ble godkjent av CECCAPP, en fransk etikkomité. 1. Valg av en Side Befolkning (SP) ved Hoechst Dye utstrømning analysen Beising 50 millioner celler med Hoechst 33342 fargestoff. Forbered to 15 ml sterile rør med en konisk bunn: ett rør merket "Hoechst" og en merket "Hoechst og Verapamil". Fremstille 10 ml av 5 mM Verapamil-hydroklorid oppløsning i s…

Representative Results

Isolasjon av cscs fra HNSCC cellelinjer som kreves to påfølgende sortering på grunn av svært lav prosentandel av cscs i foreldrenes cellelinje. Den første sortering var basert på evnen til cscs å utelukke Hoechst fargestoff på grunn av for legemiddelavlevering transportører. Dette resulterte i anskaffelse på 1-5% av den totale cellepopulasjon sorteres (figur 1). Under Hoechst fargestoff negative cellesortering, sjekke størrelsen og granulering av sorterte cell…

Discussion

Denne protokollen beskriver en pålitelig fremgangsmåte for vellykket isolering av cscs fra en spesifikk cellelinje som er anvendelig for andre HNSCC cellelinjer. Isolerte hode og nakke cscs er så egnet for videre molekylær karakterisering in vitro og funksjonell validering av transplantasjon i immunodeficient mus ^19. Imidlertid kan noen endringer testes avhengig av hvilken side populasjonen eller CD44 ^høy / ALDH ^høye prosentandeler som er tilstede i den parentale cellelinj…

Materials

Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Heparin	StemcellTM Technologies	7980
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
Verapamil hydrochloride	Sigma-Aldrich	V-4629	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
ALDEFLUOR Kit	Stem Cell	1700
CD44-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	–
FaDu cell line	ATCC	HTB-43
Low anchorage plates	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDiva software v8.0.1	BD Biosciences	–