Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom (HNSCC) ilerleme anlayışı ilerlemelere rağmen, beş yıllık sağkalım oranı nedeniyle lokal nüks ve uzak metastaz düşük kalmaktadır. bu nüksetme açıklamak için bir hipotez içsel kemo ve radyo direnci mevcut kanser kök-benzeri hücreler (rulmanları) varlığıdır. Yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için, hedeflenen tedavi etkinliğini doğrulamak deney modelleri vardır ve bu nedenle CSCS tanımlanması ve izole edilmesi için güvenilir bir yöntem olması gereklidir. Bu amaçla, flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması tarafından gerçekleştirilen iki ardışık hücre sortings (FACS) birleştirilmesine dayanır, insan HNSCC hücre çizgilerinden CSCS izolasyonu için bir protokol mevcut. İlki, diğerleri arasında, dışlamak böylece Kaset (ABC) taşıyıcı proteinler ATP-bağlama ve aşın için CSCS özelliğine dayanmaktadır gibi Hoechst 33342. hücreleri gibi hayati DNA boyalar th ile sıralanıryöntem, bir "yan nüfus" (SP) olarak tanımlanır edilir. SP hücreleri düşük bir yüzde ebeveyn hücrelerinin (<% 5) 'i temsil olarak, giderek artan bir fazı ikinci hücre sıralama önce sayısını arttırmak için gereklidir. Bir sonraki adım, iki HNSCC kök hücre özellikleri hücresi yüzey markerine CD44 (yüksek CD44) ve aldehit dehidrojenaz aşırı ifadesi (ALDH yüksek) yüksek ekspresyon seviyesi, yani sahip hücrelerin seçilmesine izin verir. Tek bir belirteç kullanımı CSCS, SP kombinasyonu izolasyonu için çok sayıda sınırlamalar ve tuzaklar olduğundan, CD44 ve ALDH belirteçleri canlı hücreleri gerektiren başka analitik ve fonksiyonel testleri için CSCS izole etmek için yararlı bir araç sağlayacaktır. CSCS sap benzeri özellikleri son tumorispheres oluşumu ve β-katenin sentezlenmesi ile in vitro koşullarında doğrulanmıştır.
Baş ve boyun yassı hücreli karsinom (HNSCC), tüm dünyada sık görülen ve mevcut tedavilerde kaydedilen ilerlemelere rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların prognozu kötüdür. Hastanın genel 5 yıllık sağ kalım oranı cerrahi, kemo-radyoterapi ve hedeflenen-terapiler dahil terapötik yaklaşımların kombinasyonu rağmen% 30 civarında olduğunu. Son çalışmalar antikanser tedaviler 1 Aşağıdaki kanser kök benzeri hücrelerin hayatta kalma (rulmanları) için lokal nüks ve uzak metastaz bağlıyor. Göğüs, beyin, prostat, akciğer, kolon, pankreas, karaciğer ve deri 2- dahil olmak üzere çeşitli katı tümörlerin kök hücrelerin özelliklerini (farklılaşmamış durum, kendini yenileme ve farklılaşma kapasitelerinin ve telomeraz aktivitesi) sunan hücrelerin varlığını destekleyen artan kanıtlar vardır 10. Ancak, CSCS kökeni 11,12 belirsizliğini koruyor. Normal kök hücreleri 3,13 veya dedifferen malign transformasyonu kaynaklanabilirCSCS benzeri özellikler 14,15 kazanmak tümör hücrelerinin sokan. Bu nedenle, CSCS ilişkin belirgin yollarının anlaşılmasında erken tanı ve dirençli HNSCC tedavisi konusunda bilgi verilecektir.
CSCS ayrıca tümör hücrelerinin 16-19 toplu karşılaştırıldığında tümör nüks sonuçlanan standart kemoterapi ve radyoterapi kaçmasına dirençli fenotipleri, sahip ve 20 nişler hipoksik içine lokalize olduğu öne sürülmüştür. Sayısız faktör gibi sessizliğini eğilimi olarak CSCS bu dirençleri, gelişmiş DNA onarım, up-regüle hücre döngüsü kontrol mekanizmaları ve serbest radikal süpürücü 21 açıklamak için öne sürülmüştür. Dahası, çeşitli onkojenik moleküler yollar özellikle CSCS 17 aktive edilebilir. daha hedefli tedaviler için CSCS bilgi geliştirmek için, kök hücre ile ilgili markörlerin heterojen bağlı, tanımlama ve CSCS izolasyonu için güvenilir yöntemler mikanser 22 çeşitli.
HNSCC olarak, kök benzeri tümör başlatan hücreleri, ilaç dışarı atım taşıyıcıları ifade 23, CD44 yüksek, CD24 düşük CD133 yüksek, c-Met + 10,24 fenotipe gibi farklı CSC biyobelirteçlerini (ifade hücreleri sıralayarak primer hasta tümörlerinden izole edilmiştir, 25 ya da ALDH yüksek aktiviteli 26) ya da CSC özelliklere sahip squamospheres oluşturmak için birincil hasta tümörü yetiştirilmesi. Bununla birlikte, squamospheres sayısı, böylece daha fazla karakterizasyon için küçük bir örneklem büyüklüğü 27 çalışmaları vererek, iki pasaj sonra dramatik azalır. Bu nedenle, in vitro deneyler, köklü hücre hatları başlayarak CSCS bilgisini geliştirmek için deney tasarımı için daha kolay bir çözümdür.
Bu makalenin amacı, multiparametrik akım sitometri analizi a kullanarak HNSCC hücre hatları CSCS izole etmek için bir yöntem önermektirnd hücre sıralama. ALDH aktivitesinin dahil olmak üzere birçok CSCS özellikleri ile ilişki içinde CD44 ekspresyonu, yan Nüfus (SP) fenotipi sferoid oluşturma yeteneğine ve tümör gelişimini izole edilmesi ve CSCS bu alt-nüfusu karakterize etmek için kullanılır. CD44, bir hücre yüzeyi glikoproteini, hücre yapışması ve göçü katılır. CD44 yüksek kafa ve boyun kanseri modelleri 29-31 de dahil olmak üzere, CSCS 28 bir çok katı tümörlerin olarak ifade edilir. Ayrıca, CD44 yüksek hücreler 10 olamaz in vivo CD44 düşük hücrelerin ise heterojen bir tümör oluşturabilir. SP deney CSC zarı içinde aşırı taşıyıcı proteinlerin ATP-bağlayıcı kaset (ABC) ailesi ile Hoechst boya 22 akıttığı hücre ayırıcı potansiyeli dayanır. Bu deney, bu kontrol numunelerinde verapamil ABC transportör inhibitörlerinin kullanılmasını içerir. Aldehit dehidrogenaz (ALDH) ret için retinol dönüştürme görev yapan hücre içi enzimerken kök hücre farklılaşması 25,26 sırasında inoic asit elde edildi. Yüksek ALDH aktivite göstermek HNSCC 26 kök benzeri hücre davranışını ve ALDH yüksek hücrelerin çok az sayıda sergileyen hücreler in vivo 26,32 tümör oluşturmak edebiliyoruz.
Bu belirteçlerin ve özellikleri kombinasyonu başarıyla Bertrand e t arkadaşları tarafından kullanılmıştır. Vitro ve foton bu CSCS in vivo ve karbon iyon radyasyonu 19 direncini incelemek için. Bu sonuçlar açık bir şekilde, çeşitli hücre belirteçleri ve özellikleri kombinasyonu tek markör yaklaşımlara göre HNSCC CSCS popülasyonları hakkında yararlı çalışmalar için daha seçici olduğu gösterilmiştir.
Bu protokol için diğer HNSCC hücre çizgileri için geçerli olan özel bir hücre soyundan CSCS başarıyla izolasyonu için güvenilir bir yöntem tarif eder. İzole baş ve boyun CSCS bağışık yetmezliği olan farelere 19 transplantasyon in vitro ve fonksiyonel doğrulama ileri moleküler karakterizasyonu için daha sonra uygundur. Ancak, bazı değişiklikler yan nüfus veya ebeveyn hücre hattında bulunan CD44 yüksek / ALDH yüksek oranda bağlı test edile…
The authors have nothing to disclose.
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
DMEM | Gibco | 61965-026 | |
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |