En hurtig metode til Blood Processing at øge udbyttet af Plasma-peptid niveauer i Human Blood
Summary
RAPID blod behandlingsmetode kan anvendes i mennesker og giver højere peptidniveauer samt giver mulighed for vurdering af den korrekte molekylære formular. Derfor vil denne metode være et værdifuldt værktøj i peptid forskning.
Abstract
Forskning inden for regulering fødeindtagelse vinder betydning. Dette omfatter ofte måling af peptider regulerer fødeindtagelse. Til korrekt bestemmelse af et peptid koncentration, bør det være stabile under blod forarbejdning. Dette er imidlertid ikke tilfældet for flere peptider, som hurtigt nedbrydes af endogene peptidaser. For nylig har vi udviklet en blod forarbejdningsmetode ansætte R educed temperaturer, A cidification, P rotease hæmning, jeg sotopic eksogene kontroller og D ilution (RAPID) til brug i rotter. Her har vi etableret denne teknik til brug i mennesker og undersøgte nyttiggørelse, molekylær form, og cirkulerende koncentration af fødeindtagelse regulatoriske hormoner. RAPID metode forbedret genopretning for 125I-mærket somatostatin-28 (+ 39%), glucagon-lignende peptid-1 (+ 35%), acyl ghrelin og glucagon (+ 32%), insulin og kisspeptin (+ 29% signifikant ), nesfatin-1 (+ 28%), leptin(+ 21%) og peptid YY 3-36 (+ 19%) sammenlignet med standard behandling (EDTA-blod på is, p <0,001). Højtryksvæskekromatografi viste eluering af endogene acyl ghrelin på det forventede position efter hurtig behandling, medens den efter standard behandling 62% af acyl ghrelin blev nedbrudt resulterer i en tidligere top sandsynligvis repræsenterer desacyl ghrelin. Efter hurtig behandling af acyl / desacyl ghrelin-forholdet i blodet hos normalvægtige forsøgspersoner var 1: 3 i forhold til 1:23 efter standard behandling (p = 0,03). Også endogene kisspeptin niveauer var højere efter RAPID sammenlignet med standard behandling (+ 99%, p = 0,02). RAPID blod behandlingsmetode kan anvendes i mennesker, giver højere peptidniveauer og muliggør vurdering af den korrekte molekylære formular.
Introduction
I lyset af den verdensomspændende stigende forekomst af fedme 1,2, er forskning inden for regulering fødeindtagelse større betydning. Mens indtil videre kun et peptid er kendt, at der er perifert produceret og centralt virkende til at stimulere fødeindtagelse, nemlig ghrelin 3, inden for de seneste årtier, har en bred vifte af peptider er blevet identificeret som reducerer fødeindtagelse, f.eks. leptin, peptid YY (PYY) og også glukagon-lignende peptid-1 (GLP-1) og insulin 4, derfor i studier, der undersøger de regulatoriske mekanismer af sult og mæthed peptidniveauer ofte vurderes og samtidig, antages det at det undersøgte peptid er stabil og udvindes i høje udbytter under plasma formation. Men meget ofte er dette ikke tilfældet på grund af hurtig endogen opdeling som anført før til f.eks. ghrelin som nedbrydes blandt acyl til desacyl ghrelin 5. Derfor har vi for nylig beskrev RAPID metode til blod processynge i rotter beskæftiger R educed temperaturer, A cidification, P rotease hæmning, jeg sotopic eksogene kontroller og D ilution 6. Denne metode forbedret inddrivelse for 11 af 12 peptider testet og tilladt for bestemmelse af den korrekte cirkulerende molekylære form, sammenlignet med standard blod behandling (EDTA blod på is) 6. Denne metode er blevet anvendt i flere efterfølgende undersøgelser 7-12 til påvisning af cirkulerende ghrelin samt corticotropin-frigørende faktor 13. Derfor har metoden vist sig nyttig for peptid forskning i gnavere. Men da gnavere er ikke altid oversættes til en anden art, bør der etableres metoden til brug i humant blod så godt.
Formålet med den foreliggende undersøgelse var at afprøve hurtig fremgangsmåde til blod forarbejdning i mennesker sammenlignet med standard blod behandling, EDTA-blod på is, som er bredt anbefales 14 og hyppigt used i den kliniske samt forskning indstilling. Vi testede inddrivelse af et udvalg af 125 I-mærkede peptider er involveret i reguleringen af fødeindtagelse, herunder etablerede peptider samt nye kandidater for nylig foreslået at spille en rolle i fodring regulering (virkninger på fødeindtagelse er vist i tabel 1) efter forarbejdning med begge metoder. Hormoner blev også valgt til at repræsentere peptider af forskellig længde og ladning (tabel 2). Desuden for ghrelin vi undersøgte den molekylære form, (e) efter standard og RAPID metode. Endelig vurderede vi endogene ghrelin (acyl og desacyl ghrelin) samt kisspeptin niveauer, et peptid også for nylig foreslået at spille en rolle i reguleringen af fødeindtagelse 15,16 efter RAPID eller standard behandling. Derudover undersøgte vi også disse peptid-niveauer i en population af individer med en lang række af body mass index (i området fra 10.2-67.6 kg / m 2) at undersøge possible forskelle forbundet med kronisk ændret kropsvægt.
Diagnose, Vurdering, og Plan:
undersøgelse deltagere
Alle undersøgelsens deltagere var nyligt indlagt patienter (inklusion var senest to dage efter indlæggelse på hospitalet) for afdelingen for psykosomatisk medicin på Charité-Universitätsmedizin Berlin og gav skriftligt informeret samtykke. For at undgå enhver påvirkning af køn eneste kvindelige patienter blev inkluderet. I alt 42 patienter deltog i denne undersøgelse og blev inddelt i tre grupper: normal vægt (BMI 18,5-25 kg / m 2, n = 12), anorexia nervosa (BMI <17,5 kg / m 2, n = 15) og fedme (BMI> 30 kg / m 2, n = 15). Anorektiske og overvægtige patienter vardiagnosticeret i henhold til International Classification of Diseases-10 og indlagt for vægtøgning (anorexia nervosa) eller vægtreduktion (fedme), hhv. Alle normalvægtige patienter blev udelukkende indlagt på grund af somatoforme symptomer uden relevante somatiske lidelser. Patienter med gastrointestinale somatoforme symptomer eller en historie af gastrointestinale kirurgi blev udelukket. Eksklusionskriterier omfattede også en alder <18 år, nuværende graviditet og ubehandlede psykotiske sygdomme. Blodopsamling blev udført på dag 2 eller 3 efter indlæggelse, før de modtager behandling kosten for at øge eller reducere kropsvægten, hhv. Antropometriske parametre blev vurderet på samme dag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapporteret før, at den hurtige metode til blod behandling forbedret inddrivelse for 11/12 peptider i forhold til standard blod forarbejdning i rotter 6. I den foreliggende undersøgelse har vi vist, at denne metode også er egnet til anvendelse i mennesker. Efter hurtig behandling, blev opsvinget for 9 af 9 125 I-mærkede peptider testet forbedret i forhold til standard blod behandling (EDTA blod på is). Den observerede forbedring varierede fra 19-39%, hvilket sandsynligvis vil være relevant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af den tyske Research Foundation STE 1765 / 3-1 (AS) og tyske ministerium for Uddannelse og Forskning 03IPT614A (CG). Vi takker Reinhard Lommel og Petra Busse for deres fremragende teknisk support samt Karin Johansson og Christina Hentzschel om hjælp med tilrettelæggelse og gennemførelse af antropometriske målinger
Materials
| diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| chymostatin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 cartridges | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 µm |
| acyl-ghrelin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | Radioactive |
| GLP-1 | Millipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Radioactive |
| glucagon | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | Radioactive |
| insulin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | Radioactive |
| leptin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | Radioactive |
| kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | Radioactive |
| nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioactive |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | Radioactive |
| somatostatin-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | Radioactive |
| ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2.1 x 50 mm, 1.8 µm |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, several components, therefore no single catalog number | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | Radioactive |
| Total ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | Radioactive |
| Active ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioactive |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | online download |
References
- Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
- James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).
- Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).
- Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).
- Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).
- Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).
- Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).
- Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
- Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).
- Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
- Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).
- Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).
- Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
- Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).
- De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).
- Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992 (2001).
- Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).
- Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).
- Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).
- Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
- Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).
- Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
- Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).
- Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).
- Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).
- Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).
- Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
- Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).
- Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).
- Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).
- Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).
- Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).
- Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).
- Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).
- White, A., Handler, P., Smith, E. L. . Principles of Biochemistry. , (1973).
