Methoden zur Untersuchung MRP4- haltigen Makromolekulare Komplexe in der Verordnung von Fibroblast Migration
Summary
MRP4- regelt verschiedene zyklische Nukleotid-abhängige Signalereignisse einschließlich einer kürzlich aufgeklärte Rolle bei der Zellmigration. Wir beschreiben eine direkte, aber vielschichtigen Ansatz, um die nachgelagerten molekularen Targets von MRP4- zu entwirren bei der Identifizierung eines einzigartigen MRP4- Interaktom führt, die Schlüsselrollen in der fein abgestimmten Regulierung der Fibroblasten-Migration spielt.
Abstract
Multidrug resistance protein 4 (MRP4-) ist ein Mitglied der ATP-bindenden Kassette Familie von Membrantransportern und ist ein endogenes Effluxtransporter zyklischer Nukleotide. Durch die Modulation der intrazellulären zyklischen Nukleotid-Konzentration kann MRP4- mehrere zyklische Nukleotid-abhängige zelluläre Ereignisse, einschließlich der Zellmigration regulieren. Zuvor haben wir gezeigt, in der Abwesenheit von MRP4, dass Fibroblastzellen höheren intrazellulären zyklischen Nukleotide enthalten und schneller migrieren können. Um die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Erkenntnis verstehen, nahmen wir einen direkten noch mehrdimensionalen Ansatz. Zunächst isolierten wir potentielle Interacting Protein-Komplexe von MRP4- aus einer MRP4- Überexpression Zellsystem Immunpräzipitation durch Massenspektrometrie gefolgt werden. Nach der Identifizierung einzigartigen Proteine im MRP4 Interaktom verwendeten wir Ingenuity Pathway Analysis (IPA), um die Rolle dieser Protein-Protein-Wechselwirkungen im Rahmen der Signaltransduktion zu untersuchen. Wir erläutert die potential Rolle des MRP4 Proteinkomplex in Zellmigration und identifiziert F-Actin als Hauptmediator der Wirkung von MRP4 auf die Zellmigration. Diese Studie betonte auch die Rolle von cAMP und cGMP als wichtige Akteure in der Migrationsphänomene. Mit High-Content-Mikroskopie, führten wir Zell-Migration-Assays und beobachtet, dass die Wirkung von MRP4- auf Fibroblasten-Migration vollständig durch die Störung des Aktin-Zytoskelett oder Hemmung der cAMP-abhängige Kinase A (PKA) wird abgeschafft. Signalisierungs Modulationen in einem migrierenden Zellen in Echtzeit sichtbar zu machen, haben wir eine FRET-basierten Sensor zur Messung PKA – Aktivität verwendet , und die Anwesenheit von mehr polarisiertem PKA – Aktivität in der Nähe der Vorderkante des wandernden MRP4 gefunden – / – Fibroblasten, im Vergleich zu MRP4 + / + Fibroblasten. Dies wiederum kortikalen Aktin Bildung erhöht und verstärkt den Prozess der Migration. Unser Ansatz ermöglicht die Identifizierung der Proteine stromabwärts MRP4- wirkenden und bietet uns eine überAnsicht des Mechanismus in MRP4-abhängige Regulierung von Fibroblastenmigration beteiligt.
Introduction
Die Zellmigration ist ein kompliziertes Mehrstufenverfahren. Studien haben gezeigt, dass sich bei der Migration Zellen polarisiert in Vorder- und Hinterkanten. Durch die Einhaltung der extrazellulären Matrix stellt die Vorderkante die Traktion, die für die Zellkörper nach vorne zu bewegen. Schließlich rundet die Hinterkante Releases Nachläufer und den Migrationszyklus 1,2.
Zellpolarisation für eine effiziente Zellmigration wird durch räumliche Trennung von intrazellulären Signal geregelt. Cellular second messenger wie cAMP, vermitteln die Kompartimentierung der Signalereignisse , die für fein abgestimmte Richtungszellmigration 3,4. Bevorzugte Ansammlungen von cAMP und cAMP-abhängige Kinase PKA – Aktivität an der Vorderkante spielen Schlüsselrollen in Richtungszellmigration 5,6. Durch phosphorylating kleinen GTPasen wie Ras-bezogene C3 Botulinumtoxin Substrat (rac) und Zellteilungskontrollprotein 42 Homolog oder Cdc42, PKA aktiviert Aktin-verwandtes Protein 2/3 (Arp 2/3) an der Vorderkante und induziert die Bildung von Lamellipodien 7-9. PKA phosphoryliert auch eine anti-capping agent, stimuliert Vasodilatator Phosphoprotein (VASP), wodurch der 10,11 Schwingungszyklen von Membran Ausfahren und Einziehen steuert.
In den Zellen werden die cAMP – Spiegel durch drei wesentliche Prozesse geregelt: i) Synthese von Adenylatcyclase, ii) Abbau durch Phosphodiesterasen, und iii) Transport von membrangebundenen Efflux – Transporter 3. Multidrug resistance protein 4 (MRP4), ein Mitglied der ATP-bindende-Kassette (ABC) Familie von Membrantransportern, Funktionen als endogene Effluxtransporter cyclischer Nucleotide. Daher kann MRP4- intrazellulären cAMP – Spiegel regulieren und cAMP-abhängige zelluläre Signalgebung 13.11. Schneller c enthalten relativ höhere zyklische Nukleotide, Fibroblasten und wandern – / – Wir haben das in MRP4- zuvor gezeigt ,ompared zu MRP4 + / + 14 – Fibroblasten. Wir berichteten auch eine zweiphasige Wirkung zyklischer Nukleotide auf Fibroblasten-Migration. Basierend auf früheren Studien und unsere Feststellung , daß MRP4 – / – Fibroblasten im Verlauf der Migration polarisierter cAMP enthalten, die Hypothese aufgestellt , dass diese MRP4-vermittelte Regulation der Fibroblasten – Migration ist cAMP abhängig. Um den nachgeschalteten Mechanismus zu verstehen, haben wir einen direkten noch mehrdimensionalen Ansatz.
Um die Proteine im Zusammenhang und im Zusammenspiel mit MRP4- identifizieren, immunpräzipitierten wir MRP4- enthaltende makromolekulare Komplexe aus HEK293-Zellen, die über MRP4- auszudrücken. Mit Massenspektrometrie identifizierten wir mehrere MRP4–interagierende Proteine und analysiert, um ihre Vernetzung mit Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA ist ein nützliches Werkzeug Protein-Protein-Wechselwirkungen (sowohl strukturelle als auch funktionelle) und erkunden ihre Beiträge insbesondere physiologischen und pathologischen AnalyseEreignisse auf der Grundlage der Literatur und experimentelle Beweise 15,16. IPA zeigte , dass F-Aktin ein Hauptziel von Downstream MRP4 im Rahmen der Zellmigration ist , wo cAMP und cGMP die Schlüssel sind Signalmoleküle 17. Diese Daten wurden weiter bestätigt durch High-Content-Mikroskopie. High-Content – Mikroskopie kann die Zell Verhaltensweisen wie Zellmigration in eine bequemere, präzise und mit hohem Durchsatz 18 Art und Weise zu erfassen und zu analysieren. Die High-Content – Mikroskopie Daten zeigten , dass die Wirkung von MRP4 auf Fibroblasten – Migration vollständig auf Unterbrechung des Actin – Cytoskeletts oder Hemmung von PKA 17 aufgehoben wird.
Darüber hinaus haben wir ein Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) -basierte PKA Sensor die PKA Dynamik bei der Migration von Zellen in Echtzeit zu überwachen. FRET-Kinase – Sensoren bestehen meist aus spezifischen Phosphorylierungssubstrat Peptiden flankiert von CFP und YFP Fluorophore 19-21. pmAKAR3 ist eine verbesserte und michmbrane gezielte FRET-basierten PKA – Sensor, der forkhead-assoziierte Domäne 1 (FHA1) und der PKA Substratsequenz LRRATLVD 5,22 enthält. Die Phosphorylierung von pmAKAR3 durch die PKA katalytische Untereinheit erhöht FRET – Signals zwischen CFP und YFP 19. Insertion einer Lipidmodifikation Bereich in den Sensor richtet es an die Plasmamembran für PKA Dynamik überwacht wird , speziell an der Membrankammer 23 auf .
Mit pmAKAR3 haben wir gezeigt , dass die Vorderkante MRP4- der Migration – / – Fibroblasten zeigten mehr polarisiert PKA – Aktivität als MRP4- + / + Fibroblasten, was wiederum die kortikalen Aktin Formation 17 an der Zelle Vorderkante erhöht. Zusammen führten diese Ereignisse zu einer besseren zellulären Polarisation und schnellere Richtungszellmigration in Abwesenheit von MRP4-. Unsere spezifischen und direkten Ansatz Schlüssel nachgelagerten Ziele für MRP4- identifiziert und stellt eine wichtige, aber wieaus bislang unerforschten Mechanismus für MRP4–abhängige Regulation von Fibroblasten-Migration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35-mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
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