Methoden om-MRP4 bevattende macromoleculaire complexen studie in de verordening van fibroblast migratie
Summary
MRP4 regelt diverse cyclisch nucleotide-afhankelijke signalering evenementen, waaronder een recent opgehelderd rol in cel migratie. We beschrijven een directe, maar veelzijdige benadering van de downstream-moleculaire doelwitten van MRP4 resulteert in de identificatie van een unieke MRP4 interactoom die een belangrijke rol in de fine tuned regulering van de fibroblast migratie speelt ontrafelen.
Abstract
Multidrug resistentie eiwit 4 (MRP4) is een lid van de ATP-bindende cassette familie van membraan transporters en een endogeen effluxtransporter van cyclische nucleotiden. Door het moduleren van de intracellulaire cyclische nucleotide concentratie, kan MRP4 reguleren meerdere cyclisch nucleotide-afhankelijke cellulaire evenementen, waaronder celmigratie. Eerder demonstreerden we dat in afwezigheid van MRP4, fibroblastcellen bevatten hogere niveaus van intracellulaire cyclische nucleotiden en sneller migreren. Om de onderliggende mechanismen van deze bevinding begrijpen, we goedkeuring gehecht aan een directe maar toch veelzijdige aanpak. Ten eerste, die we potentiële inwerkende eiwitcomplexen van MRP4 uit een MRP4 overexpressie cel systeem met behulp van immunoprecipitatie gevolgd door massa-spectrometrie. Na het identificeren van unieke eiwitten in het MRP4 interactoom, gebruikten we Ingenuity Pathway Analysis (IPA) om de rol van deze proteïne-proteïne interacties staand in verband met signaaltransductie. We opgehelderd de potentieel rol van de MRP4 eiwitcomplex bij celmigratie geïdentificeerd F-actine als een belangrijke mediator van het effect van MRP4 op celmigratie. Deze studie benadrukte ook de rol van cAMP en cGMP als belangrijke spelers in het migratiefenomenen. Met behulp van hoge-gehalte microscopie, voerden wij cel-migratie assays en merkte op dat het effect van MRP4 op fibroblastmigratie volledig afgeschaft door verstoring van de actine cytoskelet of remming van cAMP-afhankelijke kinase A (PKA). Visualiseren signalering modulaties in een migrerende cel in real time, gebruikten we een FRET-gebaseerde sensor voor het meten van PKA activiteit en vond de aanwezigheid van polarisatie PKA activiteit bij bovenrand van het migreren MRP4 – / – fibroblasten, in vergelijking met MRP4 + / + fibroblasten. Hierdoor steeg corticale actine vorming en vergroot het migratieproces. Onze aanpak maakt de identificatie van de eiwitten downstream optreden om MRP4 en biedt ons een overGezien het mechanisme betrokken bij MRP4-afhankelijke regulatie van fibroblast migratie.
Introduction
Celmigratie is een ingewikkeld proces van meerdere stappen. Studies hebben aangetoond dat tijdens migratiecellen gepolariseerd in voorste en achterste randen. Door vast te houden aan de extracellulaire matrix, de leading edge levert de tractie nodig zijn voor de cel lichaam om vooruit te komen. Tot slot, de achterrand releases achter bijlagen en completeert de migratie cyclus 1,2.
Cel polarisatie voor een efficiënte celmigratie wordt gereguleerd door ruimtelijke segregatie van intracellulaire signalering. Cellulaire tweede messengers, zoals cAMP, bemiddelen de compartimentering van de signalering gebeurtenissen die nodig zijn voor fine-tuned directionele celmigratie 3,4. Preferentiële ophopingen van cAMP en cAMP-afhankelijke kinase PKA activiteit op de voorrand een belangrijke rol spelen in directionele celmigratie 5,6. Door fosforylatie kleine GTPases zoals Ras-gerelateerde C3 botulinum toxine substraat (Rac) en celdeling controle-eiwit 42 homoloog of Cdc42, PKEen activeert actine-gerelateerd eiwit 2/3 (Arp 2/3) aan de voorste rand en induceert de vorming van lamellipodia 7-9. PKA fosforyleert ook een anti-capping middel, vaatverwijdende gestimuleerd fosfoproteïne (VASP), waardoor regelt de oscillerende cycli van membraan uitbreiding en intrekken 10,11.
In cellen, zijn cAMP niveaus geregeld door drie belangrijke processen: i) synthese door adenylaatcyclase, ii) degradatie door fosfodiësterasen, en iii) het vervoer door membraangebonden transporters 3. Multidrug resistentie eiwit 4 (MRP4), een lid van de ATP-bindende cassette (ABC) familie van membraantransporteiwitten, functioneert als een endogene effluxtransporter van cyclische nucleotiden. Daarom kan MRP4 intracellulaire cAMP niveaus reguleren en cAMP-afhankelijke cellulaire signalering 11-13. We hebben eerder aangetoond dat MRP4 – / – fibroblasten bevatten relatief hogere niveaus van cyclische nucleotiden en migreren sneller compared tot MRP4 + / + fibroblasten 14. Ook rapporteerde een bifasisch effect van cyclische nucleotiden op fibroblastmigratie. Op basis van eerdere studies en onze bevinding dat MRP4 – / – fibroblasten bevatten meer gepolariseerd cAMP tijdens migratie veronderstelden we dat MRP4-gemedieerde regulering van de fibroblast migratie cAMP afhankelijke. Om de stroomafwaartse mechanisme te begrijpen, hebben we een directe nog veelzijdige benadering.
Om de eiwitten in verband en in samenspel met MRP4 identificeren, we immunogeprecipiteerd-MRP4 bevattende macromoleculaire complexen uit HEK293 cellen die overexpressie MRP4. Met behulp van massaspectrometrie, we geïdentificeerd multiple-MRP4 interactie eiwitten en hun interconnectiviteit geanalyseerd met behulp van Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA is een nuttig instrument om eiwit-eiwit interacties (zowel structurele en functionele) te analyseren en hun bijdragen in het bijzonder fysiologische en pathologische verkennenevents op basis van de literatuur en experimentele bewijzen 15,16. IPA vermeld dat F-actine is een belangrijke doelstelling van MRP4 stroomafwaarts in de context van celmigratie waarbij cAMP en cGMP zijn de belangrijkste signaalmoleculen 17. Deze gegevens werden verder bevestigd door een hoge gehalte microscopie. High-inhoud microscopie kan vastleggen en analyseren van cel gedrag, zoals cel migratie in een handiger, nauwkeuriger en high-throughput wijze 18. De high content microscopie gegevens tonen dat het effect van MRP4 op fibroblastmigratie volledig ingetrokken na verstoring van de actine cytoskelet of remming van PKA 17.
Daarnaast gebruikten we een Förster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde PKA sensor om de PKA dynamiek monitoren migrerende cellen in real time. -FRET gebaseerde kinase sensoren bestaan meestal uit specifieke fosforylering substraat peptiden geflankeerd door GVB en YFP fluoroforen 19-21. pmAKAR3 is een verbeterde en mijmbrane gerichte FRET-gebaseerde PKA sensor die-forkhead bijbehorende domein 1 (FHA1) en de PKA substraat sequentie LRRATLVD 5,22 bevat. Fosforylering van pmAKAR3 door de PKA katalytische subunit toeneemt FRET signaal tussen GVB en YFP 19. Insertie van een lipide wijzigingsdomein in sensor richt naar de plasmamembraan toezicht PKA dynamiek, specifiek op het membraancompartiment 23.
Gebruik pmAKAR3 hebben we aangetoond dat de voorrand van het migreren MRP4 – / – fibroblasten vertoonden polarisatie PKA activiteit dan MRP4 + / + fibroblasten, waardoor de vorming corticale actine in de cel voorrand 17 verhoogd. Samen vormen deze gebeurtenissen resulteerde in betere cellulaire polarisatie en sneller gerichte celmigratie in de afwezigheid van MRP4. Onze specifieke en directe aanpak geïdentificeerd belangrijke downstream targets voor MRP4 en vormt een belangrijke, maar alsnog van onontgonnen mechanisme voor MRP4-afhankelijke regulering van de fibroblast migratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35-mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
References
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why?. Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
- Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
- Lim, C. J., et al. Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells. Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).
- Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc. J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).
- Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. Integration of signals to the Arp2/3 complex. Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).
- Le Clainche, C., Carlier, M. F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).
- Hara, Y., et al. Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice. J Clin Invest. 121 (7), (2011).
- Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).
- Cheepala, S., et al. Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).
- Sinha, C., et al. Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides. J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).
- Popovici, C., et al. Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome. BMC Genomics. 7 (105), (2006).
- Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer’s disease. Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).
- Sinha, C., et al. PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration. Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).
- Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer. 12 (154), (2012).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Sinha, C., et al. Forster resonance energy transfer – an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling. Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).
- Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells. Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).
- Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).
- Yamaguchi, H., Condeelis, J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).
- Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. Endothelial cell migration during angiogenesis. Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).
- Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).
- Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. Cell migration at a glance. J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).
- Zaccolo, M., et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).
