שיטות לחקר Mrp4 המכילים מכלולים Macromolecular בחוק הסדרת פיברובלסטים הגירה
Summary
MRP4 מסדיר אירועי איתות נוקלאוטיד תלוי מחזוריים שונים, כולל תפקיד הובהר לאחרונה נדידת תאים. אנו מתארים גישה ישירה, אך רבה לפענח את המטרות המולקולריות במורד הזרם של MRP4 וכתוצאה מכך ההזדהות של interactome MRP4 ייחודי שמנגן תפקידי מפתח בוויסות מכוונת-הקנס של הגירה פיברובלסטים.
Abstract
Multidrug התנגדות חלבון 4 (MRP4) הוא חבר של המשפחה קלטת ATP-מחייב של מובילי הממברנה הוא טרנספורטר בזרימת אנדוגני של נוקלאוטידים מחזורית. על ידי ויסות ריכוז נוקלאוטיד מחזורי תאי, MRP4 יכול לווסת אירועים הסלולר נוקלאוטיד התלוי מחזוריים מרובים כולל נדידת תאים. בעבר, הראינו כי בהעדר MRP4, תאי פיברובלסטים מכילים רמות גבוהות יותר של נוקלאוטידים מחזורי תאי והוא יכול להעביר מהר יותר. כדי להבין את המנגנונים של ממצא זה, אימצנו גישה ישירה עדיין רב פנים. ראשית, אנחנו מבודדים מתחמי חלבון אינטראקציה הפוטנציאל של MRP4 ממערכת התא MRP4 יתר ביטוי באמצעות immunoprecipitation ואחריו-ספקטרומטריית מסה. לאחר זיהוי חלבונים ייחודיים interactome MRP4, השתמשנו שנינות ניתוח נתיב (IPA) כדי לחקור את התפקיד של אינטראקציות בין חלבונים אלה בהקשר של העברת אותות. אנו הבהרנו את פותפקיד tential של מתחם חלבון MRP4 נדידת תאים ו- F יקטין מזוהה כמתווך עיקרי של השפעת MRP4 על נדידת תאים. מחקר זה גם הדגיש את תפקידה של cAMP ו- cGMP כמו שחקני מפתח תופעות הנדידה. באמצעות מיקרוסקופ גבוהה תוכן, בצענו מבחנים-נדידת תאים ו ציינו כי השפעת MRP4 על הגירת פיברובלסטים הוא בוטל לחלוטין על ידי שיבוש cytoskeleton יקטין או העיכוב של קינאז תלוי cAMP (PKA). כדי להמחיש איתות מודולציות בתא נודד בזמן אמת, השתמשנו חיישן מבוסס סריג למדידת פעילות PKA ומצאנו, בנוכחות פעילות PKA מקוטבת יותר ליד הקצה המוביל של נודדות Mrp4 – / – פיברובלסטים, לעומת Mrp4 + / + פיברובלסטים. זה בתורו עלה היווצרות תקטין קליפת מוח augmented בתהליך של הגירה. הגישה שלנו מאפשרת זיהוי של החלבונים הפועלים במורד MRP4 ומספקת לנו עם מעללאור מנגנון המעורבים בויסות MRP4 תלוי הגירה פיברובלסטים.
Introduction
נדידת תאים היא תהליך רב שלבים מסובך. מחקרים הראו כי במהלך תאי הגירה מקוטבים לתוך מובילים ונגררים קצוות. על ידי שמירה על תאי מטריקס, את הקצה המוביל מספק את המתיחה הדרוש לגוף התא להתקדם. לבסוף, משחרר הנגרר לקצה המצורף האחורית ומשלים את 1,2 מחזור ההגירה.
קיטוב נייד עבור נדידת תאים יעילה מוסדר על ידי פרדה מרחבית של איתות תאית. שליחים משניים סלולריים, כמו קייטנה, לתווך המידור של אירועי האיתות הנדרשים 3,4 נדידת תאים כיוונית מכוילות. הצטברויות מועדפות של מחנה קינאז התלוי cAMP פעילות PKA בחוד החנית ממלאות תפקידים מרכזיים נדידת תאים כיוונית 5,6. על ידי phosphorylating GTPases הקטן כגון מצע רעלן בוטולינום C3 ראס קשור (RAC) ובקרת חלוקת תא חלבון 42 homolog או Cdc42, PKמפעיל חלבון יקטין הקשורים 2/3 (ארפ 2/3) בחוד החנית ואת הגורם להיווצרות lamellipodia 7-9. PKA גם phosphorylates סוכן אנטי מכסה, vasodilator מגורה phosphoprotein (VASP), ובכך מסדיר את מחזורי תנודתית של רחבת הממברנה הכחשה 10,11.
בתאים, רמות cAMP מוסדרות שלושה תהליכים עיקריים: א) סינתזה ידי cyclase adenylate, ii) שפלה ידי phosphodiesterases, ו- III) תחבורת ידי מובילים בזרימת קרום נכנס 3. חלבון 4 התנגדות multidrug (MRP4), חבר קסטת מחייב ATP (ABC) המשפחה של מובילי קרום, מתפקד טרנספורטר בזרימת אנדוגני של נוקלאוטידים מחזורי. לכן, MRP4 יכול לווסת את רמות cAMP תאיות cAMP תלוי הסלולר איתות 11-13. בעבר הראינו כי Mrp4 – / -, פיברובלסטים מכילים רמות גבוהות יחסית של נוקלאוטידים מחזורית ולהעביר ג מהרompared כדי Mrp4 + / + פיברובלסטים 14. גם דיווחנו השפעה בי-פאזית נוקלאוטידים מחזורי על הגירה פיברובלסטים. בהתבסס על מחקרים קודמים קביעתנו כי Mrp4 – / – פיברובלסטים מכילים cAMP מקוטב יותר במהלך הנדידה, שיערנו כי תקנה MRP4 בתיווך זה של הגירה פיברובלסטים הוא cAMP תלויים. על מנת להבין את המנגנון במורד הזרם, לקחנו גישה ישירה עדיין רב פנים.
כדי לזהות את החלבונים הקשורים ב הגומלין עם MRP4, אנו immunoprecipitated מתחמי macromolecular המכילים MRP4 מתאי HEK293 כי מעל להביע MRP4. באמצעות ספקטרומטר מסה, זיהינו חלבונים MRP4 אינטראקציה מרובים וניתח הקישוריות שלהם באמצעות ניתוח נתיב שנינות (IPA). IPA הוא כלי שימושי כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים (הן מבניות ותפקודיות) ולחקור תרומתם הפיזיולוגית ופתולוגיים בפרטאירועים על סמך הספרות וראיות ניסיוני 15,16. IPA ציין כי F- יקטין היא מטרה במורד זרם עיקרית של MRP4 בהקשר של נדידת תאים שבו cAMP ו- cGMP הוא המפתח מולקולות איתות 17. נתונים אלה אושרו עוד יותר על ידי מיקרוסקופ גבוה תוכן. מיקרוסקופיה גבוהה תוכן יכול ללכוד ולנתח התנהגויות התא כגון נדידת תאים באופן יותר נוח, מדויק תפוקה גבוהה 18. נתוני מיקרוסקופיה גבוהי תוכן הראו כי השפעת MRP4 על הגירת פיברובלסטים הוא בוטל לחלוטין על שיבוש cytoskeleton יקטין או העיכוב של PKA 17.
בנוסף, השתמשנו תהודה העברת אנרגיה פורסטר (סריג) מבוסס חיישן PKA לפקח על הדינמיקה PKA ב תאים נודדים בזמן אמת. חיישנים קינאז מבוסס סריג בדרך כלל מורכבים של פפטידים מצע זירחון הספציפיים המוקפים CFP ו fluorophores YFP 19-21. pmAKAR3 הוא משופר ואותיmbrane ממוקד חיישן PKA מבוסס סריג המכיל הקשורים-forkhead מושלם 1 (FHA1) ואת רצף מצע PKA 5,22 LRRATLVD. זירחון של pmAKAR3 ידי עליות למקטע קטליטי PKA סריג אות בין CFP ו YFP 19. קלטי תחום שינוי שומנים לתוך החיישן שממקדים אליו קרום הפלזמה לניטור דינמיקת PKA, במיוחד על תא קרום 23.
שימוש pmAKAR3, הראינו כי את הקצה המוביל של נודדות Mrp4 – / – פיברובלסטים הציג פעילות PKA מקוטבת יותר Mrp4 + / + פיברובלסטים, אשר בתורו הגדיל את ההיווצרות יקטין קליפת המוח בחוד החנית של התא 17. יחד, אירועים אלה גרמו קיטוב הסלולר טוב נדידת תאים כיוונית מהר בהעדר MRP4. הגישה הספציפית וישירה שלנו זיהתה מטרות במורד מפתח עבור MRP4 ומספקת חשוב, אבל כמומנגנון עדיין לא נחקר לרגולצית MRP4 תלוי הגירה פיברובלסטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35-mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
References
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why?. Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
- Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
- Lim, C. J., et al. Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells. Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).
- Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc. J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).
- Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. Integration of signals to the Arp2/3 complex. Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).
- Le Clainche, C., Carlier, M. F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).
- Hara, Y., et al. Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice. J Clin Invest. 121 (7), (2011).
- Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).
- Cheepala, S., et al. Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).
- Sinha, C., et al. Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides. J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).
- Popovici, C., et al. Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome. BMC Genomics. 7 (105), (2006).
- Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer’s disease. Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).
- Sinha, C., et al. PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration. Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).
- Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer. 12 (154), (2012).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Sinha, C., et al. Forster resonance energy transfer – an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling. Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).
- Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells. Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).
- Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).
- Yamaguchi, H., Condeelis, J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).
- Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. Endothelial cell migration during angiogenesis. Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).
- Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).
- Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. Cell migration at a glance. J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).
- Zaccolo, M., et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).
