Méthodes pour l'étude de complexes macromoléculaires contenant MRP4 dans le règlement du fibroblaste Migration
Summary
MRP4 réglemente les divers événements de signalisation nucléotidiques dépendant cycliques, y compris un rôle récemment élucidé dans la migration cellulaire. Nous décrivons une approche directe, mais à multiples facettes pour démêler les cibles moléculaires en aval de MRP4 aboutissant à l'identification d'un interactome MRP4 unique qui joue un rôle clé dans la régulation de fine de la migration des fibroblastes.
Abstract
Polychimiothérapie protéine de résistance 4 (MRP4) est un membre de la famille des cassettes de liaison ATP des transporteurs membranaires et est un transporteur d'efflux endogène des nucléotides cycliques. En modulant la concentration intracellulaire de nucléotides cycliques, MRP4 peut réguler des événements cellulaires multiples dépendant nucléotidiques cycliques, y compris la migration cellulaire. Précédemment, nous avons démontré qu'en l'absence de MRP4, les cellules fibroblastiques contiennent des niveaux plus élevés de nucleotides cycliques intracellulaires et peuvent migrer plus rapidement. Pour comprendre les mécanismes sous-jacents de cette constatation, nous avons adopté une approche directe encore aux multiples facettes. Tout d'abord, nous avons isolé les complexes potentiels de protéines qui interagissent de MRP4 à partir d'un système de pile à MRP4 surexpression utilisant une immunoprécipitation suivie d'une spectrométrie de masse. Après l'identification des protéines uniques dans le interactome MRP4, nous avons utilisé Ingenuity Pathway Analysis (IPA) pour étudier le rôle de ces interactions protéine-protéine dans le contexte de la transduction du signal. Nous élucidé le potentiel rôle du complexe protéique MRP4 dans la migration cellulaire et identifié F-actine comme un médiateur majeur de l'effet de MRP4 sur la migration cellulaire. Cette étude a également souligné le rôle de l'AMPc et GMPc comme des acteurs clés dans les phénomènes migratoires. En utilisant la microscopie à haute teneur, nous avons effectué des analyses de cellules migration et observé que l'effet de MRP4 sur la migration des fibroblastes est complètement abolie par la perturbation du cytosquelette d'actine ou l'inhibition de l'AMPc-dépendante kinase A (PKA). Pour visualiser les modulations de signalisation dans une cellule de la migration en temps réel, nous avons utilisé un capteur à base de FRET pour mesurer l' activité PKA et trouvé, la présence de l' activité PKA plus polarisée près de la pointe de la migration MRP4 – / – fibroblaste, par rapport à MRP4 + / + fibroblastes. Cela augmente la formation d'actine corticale et augmenté le processus de migration. Notre approche permet d'identifier les protéines qui agissent en aval MRP4 et nous donne une plusvue du mécanisme impliqué dans la régulation de MRP4 dépendant de la migration des fibroblastes.
Introduction
La migration cellulaire est un processus en plusieurs étapes compliquées. Des études ont montré que, pendant les cellules de migration sont polarisés en bords avant et arrière. En adhérant à la matrice extracellulaire, le bord d'attaque fournit la traction nécessaire pour le corps de la cellule à se déplacer vers l'avant. Enfin, les bords de fuite libère les pièces jointes arrière et complète le 1,2 du cycle de migration.
Cellule polarisation pour la migration cellulaire efficace est régulée par la ségrégation spatiale de la signalisation intracellulaire. Seconds messagers cellulaires, tels que l' AMPc, la médiation de la compartimentation des événements de signalisation nécessaires pour affiner directionnelle 3,4 de migration cellulaire. Accumulations préférentielles de AMPc et AMPc-kinase dépendante de l' activité PKA à la fine pointe jouent un rôle clé dans la migration cellulaire directionnelle 5,6. Par phosphorylant petites GTPases tels que substrat liés à Ras toxine botulique C3 (Rac) et le contrôle de la division cellulaire protéine 42 homologue ou Cdc42, PKA active la protéine apparentée à l' actine 2/3 (2/3 Arp) au niveau du bord d' attaque et induit la formation de lamellipodes 7-9. PKA phosphoryle également un agent anti-bouchage, vasodilatateur phosphoprotéine stimulée (VASP), régule ainsi les cycles d'oscillation de l' extension de la membrane et la rétraction 10,11.
Dans les cellules, les taux d'AMPc sont régies par trois processus principaux: i) la synthèse de l' adénylate cyclase, ii) la dégradation par phosphodiestérases, et iii) le transport par membranaires transporteurs d' efflux 3. Polychimiothérapie protéine de résistance 4 (MRP4), membre de ATP-binding cassette (ABC) famille de transporteurs membranaires, fonctionne comme un transporteur d'efflux endogène des nucléotides cycliques. Par conséquent, MRP4 peut réguler les taux d'AMPc intracellulaires et dépendante de l' AMPc cellulaire de signalisation 11-13. Nous avons précédemment montré que , dans MRP4 – / -, les fibroblastes contiennent des niveaux relativement élevés de nucléotides cycliques et migrent plus rapidement car rapport à MRP4 + / + 14 fibroblastes. Nous avons également signalé un effet biphasique de nucléotides cycliques sur la migration des fibroblastes. Basé sur des études antérieures et nous avons conclu que MRP4 – / – fibroblastes contiennent AMPc plus polarisée au cours de la migration, nous avons émis l' hypothèse que ce règlement MRP4 médiation de la migration des fibroblastes est AMPc dépendante. Afin de comprendre le mécanisme en aval, nous avons pris une approche directe encore aux multiples facettes.
Afin d'identifier les protéines associées et en interaction avec MRP4, on a immunoprécipité des complexes macromoléculaires contenant MRP4-de cellules HEK293 qui expriment plus MRP4. En utilisant la spectrométrie de masse, nous avons identifié plusieurs protéines MRP4 interagissant et analysé leur interconnectivité en utilisant Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA est un outil utile pour analyser les interactions protéine-protéine (à la fois structurelles et fonctionnelles) et d'explorer leurs contributions en particulier physiologiques et pathologiquesévénements basés sur la littérature et des preuves expérimentales 15,16. CPl a indiqué que la F-actine est une cible en aval de la majeure MRP4 dans le contexte de la migration des cellules où l' AMPc et du GMPc sont la clé de 17 molécules de signalisation. Ces données ont été confirmées par une teneur élevée microscopie. La microscopie à haute teneur peut capturer et analyser les comportements cellulaires telles que la migration des cellules d'une manière plus commode, précis et à haut débit 18. Les données à haute teneur en microscopie ont démontré que l'effet de MRP4 sur la migration des fibroblastes est complètement abolie perturbation du cytosquelette d'actine ou de l' inhibition de la PKA 17.
En outre, nous avons utilisé un transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) à base de capteur PKA pour surveiller la dynamique PKA dans les cellules de la migration en temps réel. Capteurs de kinase à base de FRET se composent généralement de peptides de substrat de phosphorylation spécifiques flanquées de PCP et fluorophores YFP 19-21. pmAKAR3 est un amélioré et moiMbrane ciblé PKA capteur basé sur le FRET qui contient le domaine forkhead 1 associé (FHA1) et la séquence de substrat PKA LRRATLVD 5,22. Phosphorylation de pmAKAR3 par les PKA catalytic subunit augmente FRET signal entre CFP et YFP 19. L' insertion d'un domaine de modification des lipides dans le capteur cible à la membrane du plasma pour le contrôle dynamique de la PKA, notamment au niveau du compartiment de la membrane 23.
Utilisation de pmAKAR3, nous avons démontré que la pointe de la migration MRP4 – / – fibroblastes présentaient une activité PKA plus polarisée MRP4 + / + fibroblastes, qui à son tour augmenté la formation d'actine corticale au bord d' attaque de la cellule 17. Ensemble, ces événements ont donné lieu à une meilleure polarisation cellulaire et la migration cellulaire directionnelle plus rapide en l'absence de MRP4. Notre approche spécifique et directe a identifié des cibles en aval clés pour MRP4 et fournit un élément important, mais commed'encore inexplorée mécanisme de régulation de MRP4 dépendant de la migration des fibroblastes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35-mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
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