פיתוח של<em> במבחנה</em> Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר
Summary
Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.
Abstract
Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor β, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor α. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.
Introduction
פיברוזיס מעורב בפתוגנזה של מחלות פרוגרסיבי שונות כרוניות, כגון מחלת ריאות אינטרסטיציאלית, סיסטיק לב, שחמת כבד, אי ספיקת כליות סופנית, טרשת מערכתית, ומחלות אוטואימוניות מחלה 1. בין מחלות ריאה אינטרסטיציאלית פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF) הוא מחלה מתקדמת כרונית ומראה פרוגנוזה גרועה. סימן היכר הפתולוגי של IPF הוא הפיתוח של מוקדי fibroblastic המורכבים פיברובלסטים מופעל myofibroblasts המשויכים הפרוגנוזה. מקורותיה של פיברובלסטים ריאתי כאלו מוצעות לנבוע מכמה תאים mesenchymal, כולל fibroblasts ריאות תושב במקור ומדחסים fibrocytes ממח העצם. לאחרונה, מעבר mesenchymal-אפיתל (EMT) הוצע להיות מזוהה עם ההיווצרות של תאי mesenchymal 2, ולתרום בפתוגנזה של פרעות fibrotic.
הוא חשב כי EMT משחק תפקידים חשובים בתהליך של התפתחות עוברת, ריפוי פצעים, והתקדמות של סרטן, כולל חדירת גידול וגרור 3. בעקבות התהליך של EMT, תאי אפיתל להשיג את היכולת של תאי mesenchymal ידי אובדן של סמנים אפיתל, כגון E-cadherin, ועל ידי ביטוי של סמני mesenchymal, כגון vimentin, יקטין שריר α-חלקה (SMA) 4,5. מחקרים קודמים הראו הראיות כי תהליך EMT כבר קשור להתפתחות של סיסטיק רקמות הכליה 6 וריאות 7. בנוסף, דלקת כרונית מקדמת fibrotic מחלת 8; יתר על כן, ציטוקינים דלקתיים כגון חבר superfamily גורם גידול נמק 14 (TNFSF14; LIGHT), tumor necrosis factor (TNF) -α, ו- interleukin-1β, הוכחו לשפר EMT 9-12.
assay התכווצות ג'ל קולגן, assay התכווצות תא מבוסס קולגן, אשר פיברובלסטים מוטבעים מהסוג Iקולגן ג'ל תלת ממדית, הוא אידיאל במודל חוץ גופית לצורך הערכה של התכווצות. התכווצות היא אחת הפונקציה האופיינית של פיברובלסטים ותורמת תיקון פצע נורמלי סיסטיק 13. ב assay זה, הוא חשב כי את הקובץ המצורף של פיברובלסטים Type I קולגן באמצעות מנגנוני integrin תלוי אמור לייצר מתח מכאני בתנאים מסוימים, וכתוצאה מכך להוביל להתכווצות רקמות.
כאן, בפיתוח של assay התכווצות ג'ל מדווח להיות מותאם על מנת להעריך את רכישת פונקצית התכווצות בתאים שעברו EMT. דו"ח זה מדגים כי assay שונה זו מתאימה להערכת contractility בתאי mesenchymal שעברו EMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שפותח במחקר זה כולל שני שלבים. השלב הראשון מתבצע על מנת לגרום EMT, ואילו השלב השני הוא assay התכווצות ג'ל. מאז חשוב לאשר תאים עברו EMT, שלב 2 מספק השלמה מצוינת שינויי ביטוי מורפולוגיים גן. מחקרים קודמים הראו כי EMT של תאי A549 הושר על ידי TGF-β1 רק 24; עם זאת, כפי שכב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Tadashi Koyama for technical help. This work was supported in part by JSPS KAKENHI Grant Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172; a grant to the Respiratory Failure Research Group from the Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan; a grant for research on allergic disease and immunology, Japan.
Materials
| DMEM | sigma aldrich | 11965-092 | For A549 medium |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant | Wako Laboratory chemicals | 209-16544 | |
| Recombinant Human TNF-α | R&D systems | 210-TA/CF | |
| E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #3195 | 1:3000 dilution |
| Vimentin (D21H3) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #5741 | 1:3000 dilution |
| Anti-α-Tubulin antibody | sigma aldrich | T9026 | 1:10000 dilution |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody | sigma aldrich | A5228 | 1:10000 dilution |
| Anti-N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | #610920 | 1:1000 dilution |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody) | GE Healthcare | NA931-100UL | 1:20000 dilution |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody) | GE Healthcare | NA934-100UL | 1:20000 dilution |
| blocking reagent | GE Healthcare | RPN418 | 2% in TBS-T |
| 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid | corning | #353046 | |
| 100 mm cell culture dish | TPP | #93100 | |
| DMEM, powder | life technologies | 12100-046 | For 4×DMEM |
| type 1 collagen gel | Nitta gelatin | Cellmatrix type I-A | |
| 24 well cell culture plate | AGC TECHNO GLASS | 1820-024 | |
| Gel Documentation System | ATTO | AE-6911FXN | Gel imager |
| gel analyzing software | ATTO | Densitograph, ver. 3.00 | analysing software bundled with AE-6911FXN |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | life technologies | 25300054 | |
| 24 Well Plates, Non-Treated | IWAKI | 1820-024 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | life technologies | 15250-061 | |
| RNA extraction kit | Qiagen | 74106 | |
| reverse transcriptase | life technologies | 18080044 | |
| real time PCR system | Stratagene | Mx-3000P | |
| SYBR green PCR kit | Qiagen | 204145 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | life technologies | 78429 | |
| PVDF membrane | ATTO | 2392390 | |
| protein assay kit | bio-rad | 5000006JA | |
| polyacrylamide gel | ATTO | 2331810 | |
| western blotting detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| cold CCD camera | ATTO | Ez-Capture MG/ST | |
| Trypsin inhibitor | sigma aldrich | T9003-100MG | |
| Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate | Wako Laboratory chemicals | 163-11512 | |
| polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether | Wako Laboratory chemicals | 141-08321 |
References
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).
- Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis. The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).
- Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease. Circulation. 125, 1795-1808 (2012).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Forino, M., et al. TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture. International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).
- Yang, S., et al. Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis. The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).
- Reynolds, H. Y. Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s. American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).
- Camara, J., Jarai, G. Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha. Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2 (2010).
- Kamitani, S., et al. Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells. International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).
- Mikami, Y., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells. PloS one. 9, e114791 (2014).
- Yamauchi, Y., et al. Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1. Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).
- Grinnell, F. Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction. The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).
- Ramos, C., et al. FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway . American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).
- Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition. Bioscience reports. 35, (2015).
- Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype. Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).
- Krug, M. S., Berger, S. L. First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT). Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).
- Morozumi, M., et al. Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes. Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).
- Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current protocols in protein science. Chapter 10, Unit 10.7 (2001).
- Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity. Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).
- Noguchi, S., et al. An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).
- Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT). Respiratory research. 6, 56 (2005).
- Chen, X., et al. Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling. The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).
- Saito, A., et al. An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells. PloS one. 8, e56587 (2013).
- Dvashi, Z., et al. Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury. The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).
- Hallgren, O., et al. Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients. Journal of translational medicine. 10, 171 (2012).
- Kobayashi, T., et al. Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).
- Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).
- Kohyama, T., et al. PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction. American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).
- Muir, A. B., et al. Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition. Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).
- Zhong, Q., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein. American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).
- Liu, X. Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I. Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).
