Intra-Beckenarterie Injection für effiziente und selektive Modellierung von Mikroskopische Knochenmetastasen
Summary
This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.
Abstract
Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.
Introduction
Metastasierung entfallen mehr als 90% der Todesfälle durch soliden Tumoren verursacht. Bone ist die häufigste Orgel von Metastasen verschiedener Krebsarten betroffen, vor allem Brust- und Prostatakrebs. Wenn in der Klinik diagnostiziert, in der Regel Knochenmetastasen bereits fortgeschrittenen Stadien entweder mit osteolytischen oder Osteoblasten-Veränderungen in Knochen getreten ist, oft mit neurologischen Symptomen begleitet.
Vorherige Studien konzentrierten sich überwiegend auf die offenkundige osteolytischen Knochenmetastasen 1-3, aber wir derzeit haben begrenzte Verständnis von Mikrometastasen in Knochen vor dem Beginn des osteolytischen Prozess. Dies ist zumindest teilweise aufgrund des Fehlens von geeigneten experimentellen Modellen und Ansätzen. Gentechnisch hergestellten Mausmodelle von Brustkrebs metastasiert oft an die Lungen, aber viel weniger effizient Knochen 4. Ebenso entwickeln sich die orthotop transplantierten Tumoren selten spontane Knochenmetastasen, mit einigen Knochentropischen 4T1 Brust Karzinomein Sub-Klone und MSP überexprimiert PyMT transgenes Mausmodell als Ausnahmen 5-7. Intra-Tibia – Bohrungen können Krebszellen bis auf die Knochen 8-10, aber es entstehen auch Schäden und Entzündungen zu lokalen Gewebe liefern. Derzeit intrakardiale Injektion von Brustkrebs – Zelllinien wurde die Haupt Ansatz gewesen 11-13 Knochen Kolonisation zu untersuchen. Doch nach Krebszellen in den linken Ventrikel eingeführt werden, nur ein begrenzter Anteil erreichen schließlich Knochen und Knochenmark, was es schwierig macht mikroskopische Metastasen in einer quantifizierbaren Weise zu verfolgen.
In dieser Studie stellen wir eine Technik, nämlich intra Hüftarterie (IIA) Injektion 14, selektiv Krebszellen in der hinteren Gliedmaßen Gewebe liefern, wodurch die Krebszellen in Knochen und Knochenmark Anreichern ohne Beschädigung lokale Gewebe zu verursachen. Aufgrund der Knochen Spezifität, ermöglicht dieser Ansatz auch genügend Zeit für die indolenten Krebszellen, um schließlich vor ein kolonisierenimals erliegen primären Tumoren oder Metastasen in anderen lebenswichtigen Organen. Wenn sie mit einer Vielzahl von anderen Techniken kombiniert, wie Biolumineszenz-Bildgebung, Immunfluoreszenzanfärbung und Knochenhistomorphometrie ist IIA Injektion potenziell nützlich für einen weiten Anwendungsbereich von Forschungszwecke zu Knochenmetastasen im Zusammenhang, vor allem aus der Progression zu verfolgen einzelne Krebszellen zu mehrzelligen micrometastases. Insbesondere haben wir gezeigt, dass IIA Injektion uns ermöglicht, die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und verschiedene Arten von umgebenden Zellen im Knochenmikroumgebung zu visualisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl nur die Beckenarterie das Ziel der Injektion für Krebszellen ist, empfehlen wir die Trennung der beiden Hüftvene und Arterie aus den umliegenden Geweben und als Bündel, sie gemeinsam zu heben. Dies liegt daran, die Vene und Arterie ausgiebig miteinander in Kontakt, und die venöse Gefäßwand ist dünn und ist leicht zu brechen. Daher ist für eine erfolgreiche Injektion, es spart Zeit und Mühe, die beiden Schiffe zusammen zu halten, obwohl Krebszellen nur in die Arterie injiziert werden. Ein 4-0 Seidennaht w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in Zhang lab was supported by X. H.-F. Z.’s NCI CA151293, CA183878, Breast Cancer Research Foundation, U.S. Department of Defense DAMD W81XWH-13-1-0195, a Pilot Award of CA149196-04, McNair Medical Institute and by H.W.’s U.S. Department of Defense DAMD W81XWH-13-1-0296.
Materials
| Materials | |||
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Pen/Strep Amphatericin B | Lonza Biowhittaker | 17-745E | |
| PBS | Lonza Biowhittaker | 17-516F | |
| Trypsin/EDTA solution | HyClone | SH30042.01 | |
| 45uM cell strainer | VWR International Laboratory | 195-2545 | |
| MediGel CPF with carprofen | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Buprenorphine | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Estradiol pellet | Innovative Research of America | SE-121 | |
| Ketamine and xylazine | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| Vet ointment | Controlled item from veterinary care in BCM | Avoid eye dryness | |
| Shaver | Oster | 78005-050 | For furred mice |
| Isopropyl ethanol | ACROS | 67-63-0 | |
| Betadine surgical scrub | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| #10 scalpel blades | Ted Pella, Inc | 549-3CS-10 | Multiple |
| No. 3 handle | Ted Pella, Inc | 541-31 | Need to be autoclaved |
| Sterile surgical drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | |
| Straight forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5132 | Need to be autoclaved |
| Straight fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | Need to be autoclaved |
| Edged fine forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | Need to be autoclaved |
| 4-0 Vicryl silk suture | Johnson & Johnson Health Care | J214H | |
| 31G insuline syringes | BD | 328418 | Multiple |
| Q-tips cotton swabs (Sterile) | VWR International Laboratory | 89031-272 | |
| Skin glue | Henry Schein Animal Health | 31477 | For surgery site skin closure |
| Ear Tag Applicator | Fine Science Tools | 24220-00 | |
| Ear tags | Fine Science Tools | 24220-50 | |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | LUCK | Avoid light and put on ice |
| 28G insulin syringes | BD | 329410 | For intra-orbital injection |
| Paraformadehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation |
| EDTA | OmniPur | 4050 | For bone tissue decalficication |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E stereo | |
| IVIS Lumina II imaging system | Advanced Molecular Vision | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP antibodies (JL-8) | Clontech | 632381 | |
| Anti-ALP antibodies | Abcam | ab108337 | |
| Anti-Osterix antibodies | Abcam | ab22552 |
References
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