Intra-iliaca Injection for effektiv og selektiv Modellering av Mikroskopisk Bone Metastase

Summary

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Abstract

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

Introduction

Metastaser står for over 90% av dødsfall forårsaket av solide tumorer. Ben er den vanligste organ påvirket av metastaser av forskjellige typer kreft, spesielt brystkreft og prostatakreft. Når diagnostisert i klinikken, benmetastaser vanligvis har allerede lagt inn avanserte stadier med enten osteolytiske eller osteoblastiske endringer i bein, ofte ledsaget med nevrologiske symptomer.

Tidligere studier hovedsakelig fokusert på overt osteolytiske benmetastaser ^1-3, men vi i dag har begrenset forståelse av mikrometastaser i skjelettet før utbruddet av osteolytic prosessen. Dette er i det minste delvis på grunn av mangel på egnede eksperimentelle modeller og tilnærminger. Genmanipulerte musemodeller av brystkreft ofte metastaserer til lungene, men mye mindre effektivt til bein ^4. Likeledes orthotopically transplanterte svulster sjelden utvikle spontane benmetastaser, med noen bein-tropisk 4T1 mammary carcinomen sub-kloner og MSP overexpressed PyMT transgen musemodell som unntak ^5-7. Intra-tibial boring kan levere kreftceller til beinet ^8-10, men det medfører også skader og betennelser til lokale vev. Foreløpig intra-kardial injeksjon av brystkreftcellelinjer har vært den store tilnærming for å undersøke bein kolonisering ^11-13. Men etter kreftceller blir innført i venstre hjertekammer kun en begrenset andel vil til slutt nå ben og benmarg, noe som gjør det vanskelig å spore mikroskopiske metastaser på en kvantifiserbar måte.

I denne studien, etablerer vi en teknikk, nemlig intra bekkenarterie (IIA) injeksjon ^14, for selektivt å levere kreftceller i bakben vev, for derved å anrike kreftceller i ben og benmarg uten å forårsake skade på lokale vev. På grunn av benet spesifisitet, kan denne fremgangsmåten også nok tid for lat kreftceller til slutt å kolonisere før enimals bukke til primære svulster eller metastaser i andre vitale organer. Når det kombineres med en rekke andre teknikker, for eksempel bioluminescence bildebehandling, immunfluorescens farging og benhistomorfometri, er IIA injeksjon potensielt nyttig for et bredt omfang av forskningsformål knyttet til skjelettmetastaser, særlig for å spore utviklingen fra enkeltkreftceller til multi-celle mikrometastaser. Spesielt viste vi at IIA injeksjon gjør oss i stand til å visualisere samspillet mellom kreftceller og ulike typer omgir cellene i beinet mikromiljøet.

Protocol

Alle dyr arbeidet ble utført i henhold til retningslinjene fra Baylor College of Medicine dyr omsorg. 1. Cell Forberedelse Merknad: Forskjellige kreftcellelinjer kan brukes til IIA injeksjon, avhengig av forskningsformål. Vi har brukt brystkreft cellelinjer MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 og prostatakreft cellelinje c4-2 i vår forskning. Vi bruker vanligvis både GFP- og ildflueluciferase merkede kreftceller for vår studie og viser noen data…

Representative Results

Figur 1 illustrerer den anatomiske plassering og forhold av felles bekkenarterie (rød) og vene (blå). Figur 2 viser relative stilling av iliac årer og nerver i henhold til disseksjon mikroskopi. Som vist i figur 2A, kar og nerver er rett under peritoneal vegg og kan bli avdekket etter at huden innsnitt er gjort, og peritoneum skyves bort. Den felles iliaca vene ligger på v…

Discussion

Selv om bare den bekkenarterien er målet for injeksjon for kreftceller, anbefaler vi separasjon av både hofte venen og arterien fra omkringliggende vev, og å løfte dem sammen som en pakke. Dette er fordi den vene og arterie utstrakt kontakt med hverandre, og den venøse beholderveggen er tynn, og er lett å bryte. Derfor, for en vellykket injeksjon, det sparer tid og krefter på å holde opp de to skipene sammen, selv om kreftceller blir injisert kun til arterien. En 4-0 silke sutur brukes til å hjelpe denne proses…

Materials

Materials
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Strep Amphatericin B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Trypsin/EDTA solution	HyClone	SH30042.01
45uM cell strainer	VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF with carprofen	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Buprenorphine	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Estradiol pellet	Innovative Research of America	SE-121
Ketamine and xylazine	Controlled item from veterinary care in BCM
Vet ointment	Controlled item from veterinary care in BCM		Avoid eye dryness
Shaver	Oster	78005-050	For furred mice
Isopropyl ethanol	ACROS	67-63-0
Betadine surgical scrub	Controlled item from veterinary care in BCM
#10 scalpel blades	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	Multiple
No. 3 handle	Ted Pella, Inc	541-31	Need to be autoclaved
Sterile surgical drape	Sai Infusion Technology	PSS-SD1
Straight forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5132	Need to be autoclaved
Straight fine forceps	Fine Science Tools	11253-20	Need to be autoclaved
Edged fine forceps	Fine Science Tools	11253-25	Need to be autoclaved
4-0 Vicryl silk suture	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31G insuline syringes	BD	328418	Multiple
Q-tips cotton swabs (Sterile)	VWR International Laboratory	89031-272
Skin glue	Henry Schein Animal Health	31477	For surgery site skin closure
Ear Tag Applicator	Fine Science Tools	24220-00
Ear tags	Fine Science Tools	24220-50
D-luciferin	Gold Biotechnology	LUCK	Avoid light and put on ice
28G insulin syringes	BD	329410	For intra-orbital injection
Paraformadehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	For tissue fixation
EDTA	OmniPur	4050	For bone tissue decalficication
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissection microscope	Leica	Leica S6E stereo
IVIS Lumina II imaging system	Advanced Molecular Vision
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-GFP antibodies (JL-8)	Clontech	632381
Anti-ALP antibodies	Abcam	ab108337
Anti-Osterix antibodies	Abcam	ab22552