Aislamiento de células endoteliales de ratón coronaria
Summary
This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
Abstract
Las células endoteliales revisten la pared interna de los vasos sanguíneos y juegan un papel importante en la regulación del tono vascular, la permeabilidad vascular y la formación de nuevos vascular. disfunción de la célula endotelial está implicada en el desarrollo y la progresión de muchas enfermedades cardiovasculares que incluyen la enfermedad cardíaca isquémica. Para examinar la función y caracterización de células endoteliales coronarias, aislamiento de células es el primer paso y requiere alta pureza y cantidad para llevar a cabo los experimentos posteriores. Este protocolo describe un método eficaz para aislar las células endoteliales coronarias de ratón adulto. El corazón de ratón se diseca y picada en trozos pequeños. Después de la digestión del corazón usando dispasa y colagenasa II, las células se lavaron y se incubaron con perlas magnéticas que están conjugados con el anticuerpo anti-CD31. Las perlas con las células endoteliales son lavados varias veces y están listos para usar en diversas aplicaciones, incluyendo formación de imágenes y EXPERIME biológica molecularNTS. Aislamiento eficaz rinde aproximadamente 10 4 células por un solo corazón con más del 90% de pureza.
Introduction
Los modelos de ratón de diversas enfermedades cardiovasculares y los trastornos metabólicos tienen cambios fisiológicos y moleculares que son similares a los encontrados en pacientes. Por otra parte, la alteración genética de los ratones es una poderosa herramienta que nos permite investigar el papel patogénico de genes específicos en el desarrollo y progresión de enfermedades. Hoy en día, gen-knock-in célula de tipo específico o ratones salida privado se generan fácilmente en muchos laboratorios y la medición de los niveles de ARNm y de proteína en tipos específicos de células es el primer paso en la determinación de si los ratones fueron verdaderamente genéticamente modificados.
El endotelio es una capa delgada única de las células endoteliales (EC) que recubre la pared vascular interior. Las células endoteliales juegan un papel crítico en la regulación de la tensión vascular, permeabilidad vascular, y la formación de nuevos vascular 1,2. La disfunción endotelial es una característica de muchas condiciones patológicas y los cambios en la función endotelial puede conducir a diversas cocheenfermedades cardiovascu- 3,4. Por tanto, es importante para estudiar la función de las células endoteliales en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas.
Hay varias maneras para aislar ECs 5-8 y el método de aislamiento tiene que ser optimizada en función de los cuales se utilizan tejidos y especies. Esto se debe a ECs de diferentes tejidos muestran un alto nivel de heterogeneidad con respecto a sus marcadores de superficie y la expresión de proteínas 9. éxito en el aislamiento de las células endoteliales a menudo puede ser difícil y requiere un cierto grado de entrenamiento y práctica. Una vez logrado, el método de aislamiento se propone en este protocolo resulta ser estable y eficiente.
El objetivo general de este método es la obtención de ratón EC coronaria (MCECs) de alta calidad y la cantidad. A pesar de que la cantidad de las células recogidas de un corazón es menor que las células recogidas de otros tejidos que utilizan otras técnicas, esta técnica todavía proporciona apuestater calidad. La pureza de las células endoteliales en la población resultante es mayor que 90%. Por lo tanto, esta técnica sería ideal para aplicaciones que dependen de las células endoteliales puramente aislados, como imágenes de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células endoteliales más ampliamente utilizado en la investigación son células humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) debido a su comodidad y facilidad de cultivo. Sin embargo, una gran cantidad de investigación requiere la disponibilidad de un modelo fisiológico alcanzado por el aislamiento de células endoteliales de otros órganos específicos 10. Las células endoteliales forman una población muy minoritaria de las células en el tejido del corazón; su aislamiento y el cultivo puede ll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (HL115578 de A. Makino).
Materials
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
| Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | BD | 356006 | Corning |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |
References
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
