Coculture فحوصات لدراسة البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة تحفيز من ورم أرومي دبقي الغزو
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
ورم أرومي الأشكال (الصف الرابع الورم) هو سرطان البشري عدوانية جدا مع بقاء متوسط آخر التشخيص 1 سنة. وعلى الرغم من زيادة فهم الأحداث الجزيئية التي تؤدي إلى glioblastomas، هذا النوع من السرطان لا يزال الحرارية العالية إلى وسائل العلاج التقليدية. الاستئصال الجراحي لأورام الدماغ عالية الجودة ونادرا ما كاملة نظرا لطبيعة الارتشاحي للغاية من خلايا ورم أرومي. لذا النهج العلاجية التي تخفف من غزو الخلايا ورم أرومي هو خيارا جذابا. وقد أظهرت مختبرنا وغيرها من الجهات التي ورم الضامة المرتبطة بها والخلايا الدبقية الصغيرة (الضامة الدماغ المقيمين) دفعة قوية غزو ورم أرومي. يتم استخدام بروتوكول صفها في هذه الورقة إلى نموذج ورم أرومي-بلعم / الخلايا الدبقية الصغيرة التفاعل باستخدام فحوصات في المختبر الثقافة. يمكن لهذا النهج يسهل إلى حد كبير في تطوير و / أو اكتشاف الأدوية التي تعطل التواصل مع الضامة التي تمكن هذه behav الخبيثمنطقة المحيط الهندي. أنشأنا اثنين قوية المقايسات الغزو coculture حيث تحفز الخلايا الدبقية الصغيرة / الضامة غزو الخلايا بالورم الدبقي 5-10 أضعاف. ومطلي خلايا ورم أرومي المسمى مع علامة فلوري أو التعبير بشكل جوهري بروتين فلوري دون ومع الضامة / الدبقية الصغيرة على إدراج غرفة البولي المغلفة مصفوفة أو جزءا لا يتجزأ من مصفوفة ثلاثية الأبعاد. ويتم تقييم غزو الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت على الصورة وعدد الخلايا فقط الغازية على الجانب السفلي من مرشح. باستخدام هذه المقايسات، عدة مثبطات الدوائية (JNJ-28312141، PLX3397، Gefitinib، وSemapimod)، وقد تم تحديد الذي منع البلاعم / حفز الخلايا الدبقية الصغيرة غزو ورم أرومي.
Introduction
ورم أرومي الأشكال هو سرطان الدماغ البشري عدوانية مع بقاء متوسط ما يقرب من 12 شهرا من وقت التشخيص 1،2. ورم أرومي هو واحد من أكثر أنواع السرطان الأكثر فتكا وتحديا سريريا كما هو صهر للعلاج بالادوية الكيميائية والاستئصال الجراحي. طبيعة منتشر من ورم أرومي تمكن الخلايا السرطانية تنتشر في أرجاء الدماغ العادي مما يجعل الورم متقدمة من المستحيل عمليا إلى بتر جراحيا تماما. هذا الجانب الغازية للغاية هو سمة مميزة لورم أرومي وغيرها من astrocytomas المتقدمة. ولذلك، فقد كان تركيز الكثير من الأبحاث على الآلية الجزيئية من غزو الخلايا ورم أرومي. المكروية ورم أرومي الورم تلعب دورا حيويا في تأسيس خبيثة 3-6. / عرضت الخلايا الدبقية الصغيرة ورم المرتبطة الضامة لتكون مسؤولة عن تعزيز غزو ورم أرومي 7،8. ولكن معظم هذه الدراسات قياس تأثير الضامة / الدبقية الصغيرة باستخدامالمقايسات التي تفصل بينهما جسديا من خلايا ورم أرومي. وقد وضعت مختبرنا إلى توليد تحسين المقايسات التي تسمح لنا لدراسة كيفية غزو ورم أرومي يعتمد على الضامة / الدبقية الصغيرة في cocultures وتمكننا من صورة التفاعل الجسدي بينهما أثناء الغزو.
المقايسات الكلاسيكية لقياس غزو الخلايا تتضمن "القياسية" بويدن الكيميائي الغرفة وصيغ chemoinvasion. ومطلي هنا الخلايا لدراستها في غرفة البلاستيكية التي تحتوي على فلتر البولي على الجزء السفلي الذي يحتوي على مسام الحجم المحدد (عادة ما بين 0.4 و 8 ميكرومتر في القطر). عملية غزو الخلايا ينطوي على حاجز مادي، وعادة ما تتألف من البروتين مصفوفة خارج الخلية. في مقايسة chemoinvasion، مصفوفة فضل المستخدمة Matrigel (يشار إليها فيما يلي باسم "ماتريكس")، وهي خليط من البروتين مصفوفة خارج الخلية التي يفرزها Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) خلايا فأر ساركوما وتتألف في معظمها من العقيدنوع اجين الرابع و laminin. ثم توضع الدوائر في بئر زراعة الأنسجة التي تحتوي على وسائل الإعلام ثقافة الخلية مع أو بدون عوامل النمو التي يشتبه في تحفيز الغزو. الخلايا التي لديها القدرة على أعلى الغازية سوف تغزو خلال خارج الخلية مصفوفة مرشح المغلفة على تردد أعلى والتمسك السفلي من مرشح. لقد قمنا بتعديل هذا الاختبار من أجل تقييم دور الخلايا الدبقية الصغيرة وورم الضامة المرتبطة بها على غزو الخلايا ورم أرومي.
لقد كنا قادرين على تحديد باستخدام فحوصات coculture موضح في غضون هذه الورقة أن الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أن تحفز غزو اثنين من خطوط الخلايا ورم أرومي من 5-10 أضعاف 9،10. وهذا يعكس ما لوحظ في النماذج الحيوانية من الإصابة بالورم الأرومي الدبقي. وعلاوة على ذلك، قمنا بتطوير فحص ثلاثة الغزو الأبعاد حيث / الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن فحص التفاعلات بين الخلايا ورم أرومي والضامة أكثر مباشرة. مدى غزو الخلايا ورم أرومي يحفزه macrophaغيس / الخلايا الدبقية الصغيرة في مقايسة 3D هي مماثلة لما ينظر إليه باستخدام نهج غرفة مصفوفة المغلفة. وقد وضعت فحوصات مماثلة سابقا لدراسة التفاعلات سرطان الثدي مع الضامة أثناء الغزو 11-13. يتعين على الطرق الموضحة في هذه الورقة أن تساعد في القدرة على تشريح الآلية الجزيئية (ق) من البلاعم الغزو / حفز الخلايا الدبقية الصغيرة من خلايا ورم أرومي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطبيعة الغازية للغاية من astrocytomas الدرجة العالية وورم أرومي تجعل هذه السرطانات الدماغ مميتة جدا. ولذا فمن الأهمية بمكان هو لفهم الآليات الجزيئية والخلوية من غزو ورم أرومي. عرف الكثير عن عملية الغزو ورم أرومي بالفعل 17. باستخدام صيغ الفحص المفصل في هذه الورقة، وق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
References
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. 생화학. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1., Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
