Coculture Analyser för att studera makrofager och mikroglia Stimulering av Glioblastoma Invasion
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
Glioblastoma multiforme (grad IV gliom) är en mycket aggressiv human cancer med en medianöverlevnad på ett år efter diagnos. Trots ökad förståelse för de molekylära händelser som ger upphov till glioblastom, fortfarande denna cancer mycket okänsliga för konventionell behandling. Kirurgisk resektion av hjärntumörer hög kvalitet är sällan fullständigt på grund av den mycket infiltrativ natur glioblastomceller. Terapeutiska metoder som dämpar glioblastom cellinvasion är därför ett attraktivt alternativ. Vårt laboratorium och andra har visat att tumörassocierade makrofager och mikroglia (hjärn residenta makrofager) starkt stimulera glioblastom invasion. Protokollet som beskrivs i detta dokument används för att modellera glioblastom-makrofag / mikroglia interaktion med hjälp av in vitro-kulturanalyser. Detta tillvägagångssätt kan i hög grad underlätta utvecklingen och / eller upptäckt av läkemedel som stör kommunikationen med makrofager som möjliggör detta maligna behavior. Vi har etablerat två robusta coculture invasionsanalyser där mikroglia / makrofager stimulerar gliom cellinvasion av 5-10-faldigt. Glioblastomceller märkta med en fluorescerande markör eller konstitutivt uttrycker ett fluorescerande protein är pläterade utan och med makrofager / mikroglia på matrisbelagda polykarbonat kammarinsatser eller inbäddade i en tredimensionell matris. Cellinvasion bedöms genom användning av fluorescerande mikroskopi för att bilden och räkna endast invasiva celler på undersidan av filtret. Med hjälp av dessa analyser, flera farmakologiska hämmare (JNJ-28.312.141, PLX3397, Gefitinib och Semapimod), har identifierats som blockerar makrofag / mikroglia stimulerade glioblastom invasion.
Introduction
Glioblastoma multiforme är en aggressiv human hjärncancer med en medianöverlevnad på ungefär 12 månader från tidpunkten för diagnos 1,2. Glioblastoma är en av de mest dödliga och kliniskt utmanande cancer som är refraktär mot befintliga cellgifter och kirurgisk resektion. Den diffusa karaktär glioblastom gör tumörceller att spridas över hela hjärnans normala göra avancerade tumör praktiskt taget omöjligt att kirurgiskt resect helt. Denna mycket invasiva aspekt är ett kännetecken inslag i glioblastom och andra avancerade astrocytom. Därför har fokus för mycket forskning varit på den molekylära mekanismen av glioblastom cellinvasion. Den glioblastom tumör mikro spelar viktiga roller i upprättandet malignitet 3-6. Tumörassocierade makrofager / mikroglia visade sig vara ansvarig för att främja glioblastom invasion 7,8. De flesta av dessa studier dock mätte effekten av makrofager / mikroglia med hjälp avanalyser som fysiskt skiljer dem från de glioblastomceller. Vårt laboratorium har som mål att generera förbättrade analyser som tillåter oss att studera hur glioblastom invasion är beroende av makrofager / mikroglia i samodlingar och göra det möjligt för oss att avbilda den fysiska interaktionen mellan dem under invasionen.
Klassiska analyser för att mäta cellinvasion inkluderar "standard" Boyden kammar kemotaxi och chemoinvasion format. Här de celler som skall studeras är pläterade i en plastkammare som innehåller ett polykarbonatfilter på undersidan som har porer med en viss storlek (i allmänhet mellan 0,4 och 8 ^ M i diameter). Processen för cellinvasion involverar en fysisk barriär, vanligtvis sammansatt av extracellulärt matrisprotein. I chemoinvasion analysen är den föredragna matrisen används Matrigel (hädanefter kallad "matris"), ett extracellulärt matrixprotein blandning utsöndras av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus-sarkomceller och består till stor del av collagen typ IV och laminin. Kamrarna placeras sedan i en vävnadsodlingsbrunn som innehåller cellodlingsmedier med eller utan tillväxtfaktorer som misstänks för att stimulera invasionen. Celler som har en högre invasiv kapacitet kommer att invadera genom den extracellulära matrisen belagda filtret vid en högre frekvens och vidhäfta till undersidan av filtret. Vi har ändrat denna analys för att bedöma betydelsen av mikroglia och tumörassocierade makrofager på glioblastom cellinvasion.
Vi har kunnat fastställa att använda samodling analyser som beskrivits i detta dokument som mikroglia kan stimulera invasionen av två glioblastom cellinjer med 5-10-faldigt 9,10. Detta återspeglar vad som observerats i djurmodeller av glioblastoma. Dessutom har vi utvecklat en tredimensionell invasion analys där samspelet mellan glioblastomceller och makrofager / mikroglia kan undersökas direkt. Omfattningen av glioblastom cellinvasion stimuleras av macrophaGES / mikroglia i 3D-analysen är jämförbar med vad som ses med hjälp av matrisen belagda kammar strategi. Liknande analyser har tidigare utvecklats för att studera bröstkarcinom interaktioner med makrofager under invasion 11-13. Båda metoder som beskrivs i detta dokument bör stöd i förmågan att dissekera den molekylära mekanismen (er) av makrofag / mikroglia-stimulerad invasion av glioblastomceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mycket invasiva karaktär av hög kvalitet astrocytom och glioblastom gör dessa hjärncancer mycket dödliga. Det är därför av största vikt att förstå de molekylära och cellulära mekanismer av glioblastoma invasion. Mycket har lärt sig om processen med glioblastom invasion redan 17. Använda analysformat som beskrivs i detta dokument, har vårt laboratorium visat i både mus och humana modeller som tumörassocierade makrofager kan stimulera gliom cellinvasion av 5-10-faldigt. Detta samodling mod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
References
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. 생화학. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1., Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
