Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
Glioblastom (Evre IV glioma) 1 yıl sonrası tanı medyan sağkalım çok agresif bir insan kanser türüdür. glioblastoma doğuran moleküler olayların daha iyi anlaşılmasına rağmen, bu kanser halen geleneksel tedaviye son derece dirençli olmaya devam etmektedir. yüksek dereceli beyin tümörlerinin cerrahi rezeksiyon nedeniyle glioblastoma hücreleri son derece infiltratif doğaya nadiren tamamlandı. glioblastoma hücre işgali hafifletir tedavi yaklaşımları dolayısıyla cazip bir seçenektir. Laboratuvarımız ve diğerleri bu tümör ilişkili makrofajlar ve mikroglia (ikamet beyin makrofajlar) kuvvetle glioblastoma işgali teşvik göstermiştir. Bu yazıda anlatılan protokol in vitro kültür analizleri kullanılarak glioblastoma-makrofaj / mikroglia etkileşimi modellemek için kullanılır. Bu yaklaşım büyük ölçüde bu habis Behav sağlayan makrofajlar ile iletişimi bozan ilaçların geliştirilmesi ve / veya keşif kolaylaştırabilirIOR. 10 kat – Biz mikroglia / makrofajlar 5 ile glioma hücre işgali teşvik iki güçlü kokültürünün işgali testleri kurduk. Bir flüoresan işaretleyici ya da yapısal olarak bir flüoresan proteini ifade ile etiketlenmiş glioblastoma hücrelerinin matris kaplı polikarbonat odası ekler üzerinde olmayan ve makrofajlar / mikroglia ile kaplama ya da üç boyutlu bir matris içinde yer almaktadır. Hücre işgali filtrenin alt sadece invaziv hücreler görüntü floresan mikroskopi kullanılarak ve saymak tarafından değerlendirilir. Bu tahliller kullanılarak, çeşitli farmakolojik inhibitörleri (JNJ-28.312.141, PLX3397, Gefitinib ve Semapimod) makrofaj blok tanımlanmıştır / mikroglia glioblastoma işgali uyarmıştır.
Introduction
Glioblastom tanı 1,2 andan itibaren yaklaşık 12 aylık medyan sağkalım agresif bir insan beyin kanseri olduğunu. Glioblastoma standart kemoterapi ve cerrahi rezeksiyon refrakter olarak en ölümcül ve klinik zorlu kanserlerden biridir. glioblastoma yaygın doğası cerrahi tamamen rezeke gelişmiş tümör neredeyse imkansız hale normal beyinden yayılan tümör hücrelerini tanır. Bu son derece invaziv yönü glioblastoma ve diğer gelişmiş astrositomaların damgasını özelliğidir. Bu nedenle, bir çok çalışmanın odağıdır glioblastoma hücre istilası moleküler mekanizması olmuştur. Glioblastoma tümör mikro malignite 3-6 kurulmasında hayati bir rol oynar. Tümör ilişkili makrofajlar / mikroglia glioblastoma işgali 7,8 teşvik sorumlu olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmaların çoğu, ancak kullanarak makrofajlar / mikroglia etkisini ölçtükfiziksel glioblastoma hücreleri ayırmak tahlilleri. Laboratuvarımız bize glioblastoma işgali cocultures makrofajlar / mikroglia bağlıdır nasıl çalışması ve işgali sırasında görüntü aralarındaki fiziksel etkileşimi sağlayacak izin geliştirilmiş tahlilleri üretmek için yola çıkmıştır.
Klasik deneyleri hücre işgali "standart" Boyden çemberinin kemotaksisini ve kemo-istila formatlarını içerir ölçmek için. çalışılacak Burada hücreler belirli bir boyutu (çapı genellikle arasında 0.4 ve 8 uM) gözeneklere sahip altında bir polikarbonat filtresi içeren plastik odasına yerleştirilir. hücrelerinin istilasını süreci genellikle hücre dışı matris proteini arasında oluşan fiziksel bir bariyer kapsar. kemo-istila deneyinde, kullanılan tercih edilen matris Matrigel (bundan böyle "matris" olarak anılacaktır), Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tarafından salgılanan bir hücre dışı matris proteini karışımı, fare sarkoma hücreleri ve büyük ölçüde col oluşmaktadırlagen tip IV ve laminin. Chambers, sonra ya da işgali uyarma şüphelenilen büyüme faktörleri olmaksızın hücre kültür ortamı ihtiva eden bir doku kültür çukuruna yerleştirilir. daha yüksek bir frekansta hücre dışı matris kaplı filtre ile istila ve filtrenin alt tarafına bağlı bir yüksek invaziv kapasitesine sahip hücreler. Biz glioblastoma hücre işgali üzerine mikroglia ve tümör ile ilişkili makrofajlar rolünü değerlendirmek için bu testte değiştirdiniz.
10 kat 9,10 – Biz mikroglia 5 iki glioblastoma hücre hatları işgali uyarabilir bu kağıt içinde açıklanan kokültürünün analizleri kullanılarak belirlemek mümkün olmuştur. Bu glioblastoma hayvan modellerinde gözlemlenmiştir yansıtan. Ayrıca, glioblastoma hücreleri ve makrofajlar arasındaki etkileşimler / mikroglia daha doğrudan incelenebilir üç boyutlu işgal tahlil geliştirildi. macropha ile uyarılan glioblastoma hücre invazyonu3D tahlilinde ges / mikroglia matrisi kaplı bölme yaklaşımı kullanılarak görülen şeyin karşılaştırılabilir. Benzer deneyler daha önce işgali 11-13 sırasında makrofajlar ile meme kanseri etkileşimleri incelemek için geliştirilmiştir. Bu yazıda anlatılan iki yöntem glioblastoma hücreleri makrofaj / mikroglia uyarılan işgali moleküler mekanizmasını (ler) incelemek yeteneği yardımcı olmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
yüksek dereceli astrositomların ve glioblastoma son derece invaziv doğası bu beyin kanserleri çok ölümcül olun. Bu glioblastoma işgali moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak nedenle büyük önem taşımaktadır. Çok glioblastoma işgali zaten 17 süreci hakkında öğrenilmiştir. 10 kat – Bu yazıda ayrıntılı tahlil formatları kullanarak, bizim laboratuvar tümörle ilişkili makrofajlar 5 ile glioma hücre işgali uyarabilir, hem fare ve insan modellerinde gösterilmiştir. Bu Cocultu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
References
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. 생화학. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1., Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
