In - vivo - Biosensor - Spuren Non-apoptotischen Caspase - Aktivität in Drosophila
Summary
Um gesunde Zellen in ganzen Tieren erkennen , die geringe Mengen an Caspase – Aktivität enthalten, die hochempfindliche Biosensor bezeichnet CaspaseTracker wurde für Drosophila erzeugt. Caspase-abhängigen Biosensor-Aktivität wird in langlebigen gesunden Zellen in den inneren Organen der erwachsenen Tiere aufgezogen unter optimierten Bedingungen in Abwesenheit von Tod Stimuli detektiert.
Abstract
Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.
Introduction
Caspasen sind Cystein-Proteasen, die durch Spaltung von vielen intrazellulären Proteinen nach Schlüssel Aspartatresten apoptotischen Zelltod vermitteln. Zum Beispiel aktivieren Initiator Caspasen Effektorcaspasen, dereprimieren DNA Nukleasen spalten Zytoskelett – Komponenten und die Lipidzusammensetzung von Zellmembranen verändern , um schnell Zellen abzubauen und ihre Anerkennung und engulfment stimulieren durch benachbarte Zellen , die der Zelle Leichen zu entsorgen. 1-4 Es wird geschätzt, dass Milliarden Zellen pro Tag in den menschlichen Körper sterben und Apoptose ist ein wichtiger Mechanismus der chemotherapieinduzierter Tumorzelltodes. 5 Eine andere Gruppe von Caspasen Zelltod durch verschiedene nicht-apoptotischen Prozesse führen können angeborene Immunität zu stimulieren. 6 Deshalb die meisten Untersuchungen auf Caspasen hat auf ihrer pro-Tod Funktionen konzentriert.
Interessanterweise ergab erste Hinweise auf dem Gebiet, dass die gleichen Caspasen verantwortlich für die Förderung der Zelltod auch nicht den Tod f habenSalbungen. Pionierstudien haben gezeigt , daß Caspasen in diverse zelluläre Funktionen in gesunden Zellen beteiligt sind, einschließlich der Regulation der Zellproliferation und Migration während der Embryogenese. 7-9 Caspasen erforderlich sind für spermatid Individualisierung in Drosophila 10,11, für eine alternative necroptotic Zelltod blockiert bei Mäusen 12,13 und für microRNA Verarbeitung in C. elegans. 14,15 In vielleicht die langlebigste Zellen, Neuronen, Caspasen und andere apoptotische Maschinen sind an der Regulation neuronaler Aktivität verwickelt durch synaptischen Endungen Beschneidung, ein Prozess vermutlich wesentlich sein , andere Synapsen für Lernen und Gedächtnis zu stärken. 16- 18 Es ist möglich , dass Caspasen synaptic pruning durch eine Art Mini-Apoptose von neuronalen winzigen Vorsprünge ohne ganze Zelltod erleichtern. 19 jedoch Caspasen alternative Funktionen haben in keinem Zusammenhang mit der Apoptose-ähnlichen Ereignissen. 20,21 Dual – Rolles im Leben und Tod sind nicht einzigartig für Caspasen; BCL-2 – Familie Proteine und Cytochrom c haben Rollen in zelluläre Energetik in gesunden Zellen , sondern sind auch Teil des Kerns apoptotischen Weg, der von vielen Arten von Zellstress aktiviert. 22-25 Obwohl nicht bewiesen ist , scheint es logisch , dass die Evolution Tag verknüpft hat -Jobs zu Tode-Arbeitsplätze innerhalb der gleichen Moleküle rechtzeitige Beseitigung von untauglich oder unerwünschte Zellen zu gewährleisten.
Gegenwärtig sind die molekularen Mechanismen von nicht-apoptotischen Caspase-Aktivität nicht verstanden, und das Ausmaß der nicht-apoptotischen Caspase-Aktivität während der embryonalen Entwicklung und in erwachsenen Geweben ist auch nicht bekannt. Eine große Herausforderung ist die Schwierigkeit, Tag-Jobs aus dem Tod Jobs von Caspasen zu unterscheiden. Im Gegensatz zur Apoptose und pyroptosis, als Caspase-Aktivität durch eine proteolytische Kaskade verstärkt wird, werden die Tag-Jobs von Caspasen erwartet bei wesentlich geringeren Mengen an enzymatischer Aktivität auftreten, wahrscheinlich unter der Nachweis von vielen verfügbaren technologien.
Vor der vorliegenden Arbeit entwickelt andere eine Vielzahl von Caspase Biosensoren für verschiedene Zwecke. Die SCAT Biosensoren (zB ECFP-DEVD-Venus) schnell in Echtzeit Caspase – Aktivität in kultivierten Zellen und tierischen Geweben erkennen FRET verwenden. 26,27 Nach Caspase – Spaltung, die Kern gezielte GFP – Einheit von Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) erfährt subzellulärer Relokalisation innerhalb von Minuten , wenn seine Plasmamembran-Haltegurt durch Caspasen gespalten wird. 28 in ähnlicher Weise ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relokalisiert aus dem Cytosol in den Zellkern auf Caspase – Spaltung. 29,30 Mehr Vor kurzem wurde das Chromophor in iCasper geschickt entwickelt , wenn sie von Caspasen gespalten zu fluoreszieren, ermöglicht Detektion von Biosensor – Aktivität in Echtzeit in Neuronen von Drosophila – Embryonen, sondern in erster Linie in Verbindung mit Entwicklungs Zelltod. 31 Caspase-abhängigen Tod von olfaktorischen Neuronen während alterte demonstbewertet durch Immundetektion der Caspase-gespaltenen Form von CPV Biosensoren (beispielsweise mCD8-PARP-Venus). 32,33 Wichtig ist , dass die aktivierte Form von Caspase-3 in Abwesenheit von Zelltod durch sensitive immunostain in Stacheln detektierter kultivierten Neuronen und im Soma die Caspase-abhängigen Fluoreszenz des Kern CellEvent Reporterfarbstoff verwenden, aber Schwierigkeiten aufgrund Phototoxizität angetroffen wurden, obwohl Zelltod erst nach spine Eliminierung verzögert. 19 Somit werden neue Caspase Biosensoren erforderlich nachzuweisen und verfolgen Zellen mit basalen Caspase – Aktivität in vivo.
Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, haben wir einen einen neuen Dual Farbe Caspase Biosensor bezeichnet CaspaseTracker. Diese Strategie kombiniert eine modifizierte Version der Drosophila Caspase-sensitive Apoliner Biosensors 28 mit dem Drosophila G-TRACE FRT – Rekombinase – System 34 permanent zu markieren und die Zellen in vivo zu verfolgen. <sup> 35 Die Gal4-aktivierte G-TRACE – System ermöglicht ein sehr niedriges Niveau von Caspasen CaspaseTracker zu aktivieren, was zu RFP Expression im Zytoplasma und permanent kern gezielte GFP – Expression in einer beliebigen Zelle , die je Caspase – Aktivität erfahren hat. 35 Dieses System kann etikettieren Zellen im Laufe des Lebens in ganzen Tieren unter Verwendung von Drosophila melanogaster, ein lenkbar und am weitesten verbreiteten Modellsystem für die Untersuchung von Caspasen und Zelltod. 36-38
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir die Konstruktion und Funktionsweise von CaspaseTracker, die Erkennung von weit verbreiteten basalen Caspase-Aktivität in gesunden Geweben erleichtern. Die kritischen Schritte zum Detektieren nicht-apoptotischen Caspase – Aktivität in vivo sind: 1) Fliegen mit dem Biosensor – Transgen zu erzeugen, 2) Caspase-spezifische Reporterfunktion mit geeigneten Kontrollen Verifizieren, 3) Praktizieren Techniken dissection alle inneren Organsysteme adulter Drosophila zu beobachten, und 4) Scheidu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Polan Santos und Darren Obbard für Drosophila Abbildungen in Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena für die Verwendung des JHMRI Insektarium. Diese Arbeit wurde von der Life Science Research Foundation Fellowship (HLT), University Grants Committee der Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) unterstützt wurde, und NIH gewährt NS096677, NS037402 und NS083373 (JMH). Ho Lam Tang ist ein Shurl und Kay Curci Foundation Fellow der Life Sciences Research Foundation.
Materials
| CONSUMABLES AND REAGENTS | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| EQUIPMENT | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W | AmScope | WBM99316 | Light source |
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