מבעד למראה: זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב אורך של תאים בודדים כדי ללמוד Therapeutics אנטי-סרטניות
Summary
Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
Abstract
התגובה של תאים בודדים לתרופות אנטי-סרטניות תורמת באופן משמעותי בקביעת תגובת האוכלוסייה, ולכן הוא גורם מרכזי תורם בתוצאה הכללית. Immunoblotting, cytometry זרימה וניסויי תא קבוע משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד כיצד תאים מגיבים לתרופות אנטי-סרטניות. שיטות אלה חשובות, אבל יש להם חסרונות רבים. משתנה הם תגובות סמים בין סרטן תאים נורמלים, ובין תאים ממוצא הסרטן שונה, וחולף ותגובות נדירות שקשה להבין באמצעות מבחני מיצוע אוכלוסייה וללא יכולת לעקוב ישירות ולנתח אותם אורכים. המיקרוסקופ הוא גם מתאים במיוחד לתאים חיים תמונה. התקדמות הטכנולוגיה מאפשרת לנו תאי תמונה שגרתי ברזולוציה המאפשרת לא מעקב תא בלבד, אלא גם את התצפית של מגוון תגובות הסלולר. אנו מתארים גישה בפירוט המאפשר הדמיה זמן לשגות רציפה שלתאים במהלך תגובת התרופה בעצם כל עוד רצוי, בדרך כלל עד 96 שעות. באמצעות וריאציות של הגישה, ניתן לנטר תאים במשך שבועות. עם העסקה של תהליכים רבים biosensors פלורסנט מקודד גנטי, שבילים ותגובות יכולה להיות אחריו. אנו מציגים דוגמאות הכוללות מעקב וכימות של גדילת התא התקדמות מחזור התא, דינמיקה כרומוזום, נזק לדנ"א, מוות של תאים. כמו כן נדונו וריאציות של הטכניקה והגמישות שלה, ולהאיר כמה מלכודות נפוצות.
Introduction
מיקרוסקופיה Live- תא מעקב אורך של תאים בודדים היא לא טכניקה חדשה. מתוך המיקרוסקופים המוקדמים, חובבי מדענים הבחינו ולומדים תאים בודדים ואורגניזמים, ההתנהגויות שלהם, ופיתוח 1-3. דוגמה מפורסמת מן דיוויד רוג'רס המנוח באוניברסיטת ונדרבילט בשנת 1950 מראה נויטרופילים האדם כתם דם רודפים חיידק סטפילוקוקוס ולבסוף בתהליך של phagocytosis 4. חי בסרט תא זו הוא המחשה מצוינת לאופן שבו מספר רב של תהליכים שניתן לצפות בקורלציה בניסוי יחיד: חישה של שיפוע כימי, מכניקה ומהירות תנועתיות תא, תא מעצבת דינמיקה, הדבקה, ואת phagocytosis של פתוגן.
הופעתו של מיקרוסקופים אוטומטיים לחלוטין ומצלמות דיגיטליות רגישות גבוהה הביאה מספר גדל והולך של חוקרים באמצעות מיקרוסקופ לשאול שאלות יסוד f החל הביולוגיה של תאrom כיצד תאים להעביר 5,6 ולחלק 7,8 כדי אברון הדינמיקה וסחר הממברנה 9-11. ללא פלורסנט, מיקרוסקופיה brightfield, כולל שלב בניגוד (PC), אשר זכה בפרס נובל פריץ Zernike בשנת 1953, ואת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) לאפשר תצפית של תאים גרעינים, אלא גם במבנים המשנה הסלולר כולל חבילות microtubule , כרומוזומים, nucleoli, דינמיקת אברון, וסיבים יקטינו עבים 12. מקודד גנטית חלבוני ניאון לבין התפתחות של צבעי ניאון נגד אברונים השפיעו באופן דרמטי זמן לשגות מיקרוסקופית 13-15. אמנם לא המוקד של מאמר זה, הדמית spheroids תא באתרו (מיקרוסקופיה intravital) באמצעות confocal במיקרוסקופ multiphoton מייצגת הרחבה נוספת של הגישה, ויש מאמרים מצטיינים המשתמשים ולדון הגישות הללו 16-19.
התגובות של תאי אל-canc אנטיתרופות אה או מוצרים טבעיים נקבעות על הסולם המולקולרי תאי. לאחר טיפול תגובות גורלות תא הבנה כרוך לעתים קרובות מבחני מיצוע אוכלוסייה (למשל., Immunoblotting, אמצעים היטב שלמים), או בזמן נקודות קבועות עם זיהוי immunofluorescent ו cytometry זרימה, אשר מודדים תאים בודדים. הטרוגניות בתגובות תא בודדות לסמים בקרב אוכלוסייה, בפרט בגידולים, עשויות להסביר חלק ההשתנות בתגובה לראות פני שורות תאים וגידולים כי מטופלים עם התרופה הזהה ב רוויה. לטווח ארוך גישות האורך לעקוב תא בודד נתון או אוכלוסייה של תאים הוא גישה נפוצה פחות, אבל רב עצמה המאפשרת לחקר הישיר של מסלולי תגובה מולקולריים, פנוטיפים שונים (למשל., מוות של תאים או חלוקת תא), תצפית של תא אל תא השתנות בתוך אוכלוסייה, ואיך הגורמים הללו תורמים דינמיקה בתגובת אוכלוסיית 20-22. באופטימיות, יכולתלהתבונן ולכמת התגובות תא בודד יעזור לשפר את הבנתנו כיצד תרופות לעבוד, למה הם לפעמים נכשלים, וכיצד להשתמש בהם בצורה הטובה ביותר.
הטכניקה של מיקרוסקופיה לטווח ארוכת זמן לשגות, מעקב אורך, וניתוח תגובות סמים היא העומד לרשות חוקרים רבים והוא יכול להיות פשוט, באמצעות אור המועבר רק להתבונן תגובות פנוטיפ 20,21. הרכיבים העיקריים של הגישה כוללים: ההיערכות מתאימה של התאים בעלי עניין, מיקרוסקופ אוטומטי עם תא סביבתי, מצלמה משולבת עם מחשב לרכוש ולאחסן את התמונות, ותוכנה לעיין לשגות זמן למדוד ולנתח את התאים וכל biosensors ניאון. אנו מספקים פרוטוקול מפורט עם טיפים רבים לניהול מיקרוסקופיה זמן לשגות של תאים בתרבית למשך עוד כמה ימים באמצעות brightfield ו / או מיקרוסקופיה epifluorescent widefield. פרוטוקול זה יכול לשמש לכל שורת תאים שניתן גדלים בתרביתללמוד התגובות שלהם לטיפולים אנטי-סרטניים. אנו מספקים דוגמאות של נתונים רכשה ונותחו באמצעות חיישנים ביולוגיים פלורסנט גנטית בקידוד שונה מרובים דוגמה מיקרוסקופיה שלב בניגוד, לדון סוגים שונים בקצרה של בדיקות, את היתרונות והחסרונות של זמן לשגות לטווח ארוך ומעקב האורך, מה יכול להיות מלומדת הגישה הזאת כי קשה להבין מן הערוצים הלא ישירים, וכמה וריאציות שאנו מקווים יהיה עניין וערך לחוקרים מנוסים שלא נחשבו בגישה, וכדי חוקרים מנוסים.
Protocol
Representative Results
Discussion
יתרונות של זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב לאורך שנים
המיקרוסקופ הוא מכשיר אידיאלי עבור מחקרים ארוכי טווח התגובה התרופה כפי שהוא מאפשר לחוקרים לעקוב אחר תאים בודדים גורלם וכן את כלל האוכלוסייה. השתנות בתגובת סמים בתוך אוכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Materials
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
| etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
| selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
| Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
| 5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
| multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
| Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon laser launch | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |
References
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
- Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
- van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, . Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
- Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
- Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
- Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
- Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
- Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
- Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
- Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques–illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
- Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
- Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
- Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
- Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
- Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
- Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
- Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
- Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
- Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
- Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
- Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
- Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
- Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- D’Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
- Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
- Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
- N’Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
- Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
- Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
- Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
- Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
- Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
- Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
- Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
- Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., Robinson, J. .. . P. a. u. l., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. 66, (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
- Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
- Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).
