Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal des cellules individuelles pour l'étude Therapeutics Anti-cancer
Summary
Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
Abstract
La réponse des cellules individuelles aux médicaments anti-cancer contribue de manière significative dans la détermination de la réponse de la population, et est donc un facteur important dans le résultat global. Immunoblotting, la cytométrie en flux et les expériences cellulaires fixes sont souvent utilisés pour étudier comment les cellules répondent aux médicaments anti-cancéreux. Ces méthodes sont importants, mais ils ont plusieurs lacunes. Variabilité dans les réponses de la drogue entre le cancer et les cellules normales, et entre les cellules d'origine du cancer différents, transitoires et réponses rares sont difficiles à comprendre en utilisant des tests population de moyenne et sans être en mesure de suivre et de les analyser longitudinalement directement. Le microscope est particulièrement bien adapté à des cellules vivantes d'image. Les progrès réalisés dans la technologie permettent de routinière les cellules d'image à une résolution qui permet non seulement le suivi des cellules, mais également l'observation d'une variété de réponses cellulaires. Nous décrivons une approche en détail qui permet l'imagerie en continu time-lapse deles cellules au cours de la réponse à un médicament pour l'essentiel aussi longtemps que souhaité, typiquement jusqu'à 96 h. Utilisation de variations de l'approche, les cellules peuvent être surveillés pendant des semaines. Avec l'emploi des codés génétiquement biocapteurs fluorescents de nombreux processus, les voies et les réponses peuvent être suivies. Nous montrons que des exemples comprennent le suivi et la quantification de la croissance cellulaire et la progression du cycle cellulaire, la dynamique des chromosomes, des lésions de l'ADN et la mort cellulaire. Nous discutons également des variations de la technique et de sa flexibilité, et mettre en évidence certains pièges courants.
Introduction
La microscopie des cellules vivantes et le suivi longitudinal des cellules individuelles ne sont pas une nouvelle technique. Dès les premiers microscopes, les amateurs et les scientifiques ont observé et étudié des cellules individuelles et les organismes, leurs comportements, et le développement 1-3. Un exemple célèbre de la fin David Rogers à l' Université Vanderbilt dans les années 1950 montre un neutrophile humaine dans un frottis sanguin chassant une bactérie Staphylococcus aureus et éventuellement le processus de phagocytose 4. Ce film live-cellule est une excellente illustration de la façon dont les processus multiples peuvent être observés et corrélées en une seule expérience: détection d'un gradient chimique, mécanique et de la vitesse de la motilité cellulaire, cellule façonne la dynamique, l'adhérence et la phagocytose d'un agent pathogène.
L'avènement des microscopes entièrement automatisés et des caméras numériques très sensibles a donné lieu à un nombre croissant de chercheurs en utilisant la microscopie à poser des questions fondamentales en biologie cellulaire allant from comment les cellules se déplacent 5,6 et 7,8 à diviser organite dynamique et le trafic membranaire 9-11. Non-fluorescent, la microscopie en fond clair, y compris à contraste de phase (PC), qui a recueilli le prix Nobel de Frits Zernike en 1953, et le contraste d'interférence différentiel (DIC) permettre l'observation des cellules et des noyaux, mais aussi des structures sous-cellulaires, y compris les faisceaux de microtubules , les chromosomes, les nucléoles, la dynamique des organites et des fibres d'actine épaisses 12. Génétiquement codés protéines fluorescentes et le développement des colorants fluorescents contre organites ont considérablement influencé time-lapse microscopie 13-15. Bien que pas l'objet de cet article, l' imagerie en sphéroïdes cellulaires et in situ (microscopie intravitale) en utilisant la microscopie confocale et multiphotonique représentent une autre expansion de l'approche, et il y a des articles en suspens qui utilisent et traitent de ces approches 16-19.
Les réponses des cellules à l'anti-cancmédicaments er ou de produits naturels sont déterminés à l'échelle moléculaire et cellulaire. Comprendre le traitement des réponses cellulaires et sorts suivants implique souvent la population (par exemple , des analyses moyennes., Immunoblot, des mesures entières de puits), ou points de temps fixes avec détection par immunofluorescence et la cytométrie de flux, qui mesurent des cellules individuelles. Hétérogénéité dans les réponses des cellules individuelles à des médicaments au sein d'une population, en particulier dans les tumeurs, peut expliquer en partie la variabilité de la réponse observée dans les lignées cellulaires et les tumeurs qui sont traités avec le même médicament à saturation. À long terme des approches longitudinales de suivre une seule cellule donnée ou une population de cellules est une approche moins commune , mais très puissant qui permet l'étude directe des voies de réponse moléculaire, différents phénotypes (par exemple., La mort cellulaire ou la division cellulaire), l' observation de la variabilité de cellule à cellule dans une population, et comment ces facteurs contribuent à la dynamique de la réponse de la population 20-22. Optimiste, pouvoird'observer et de quantifier les réponses des cellules individuelles contribuera à améliorer notre compréhension de la façon dont les médicaments fonctionnent, pourquoi ils ne parviennent pas toujours, et comment les utiliser au mieux.
La technique de la microscopie à long terme time-lapse, suivi longitudinal, et l' analyse des réponses des médicaments est disponible pour de nombreux chercheurs et peut être simple, en utilisant la lumière uniquement transmis à observer le phénotype des réponses 20,21. Les principales composantes de l'approche comprennent: la préparation appropriée des cellules d'intérêt, un microscope automatisé avec la chambre de l'environnement, un appareil photo intégré à un ordinateur pour acquérir et stocker les images, et le logiciel pour examiner le time-lapse et de mesurer et d'analyser les cellules et tous les biocapteurs fluorescents. Nous fournissons un protocole détaillé avec de nombreux conseils pour la conduite Vidéomicroscopie des cellules cultivées aussi longtemps que plusieurs jours en utilisant clair et / ou microscopie épifluorescence widefield. Ce protocole peut être utilisé pour toute lignée cellulaire qui peut être cultivée dans une culturepour étudier les réponses aux traitements anti-cancéreux. Nous fournissons des exemples de données acquises et analysées en utilisant plusieurs différents biocapteurs fluorescents génétiquement codés et un exemple de la microscopie à contraste de phase, discuter brièvement les différents types de sondes, les avantages et les inconvénients à long terme time-lapse et le suivi longitudinal, ce qui peut être appris pour cette approche qui est difficile à comprendre des approches non-directes, et quelques variations que nous espérons être d'intérêt et de la valeur pour les chercheurs inexpérimentés qui ne l'ont pas envisagé d'utiliser l'approche et à des chercheurs expérimentés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avantages de Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal
Le microscope est un instrument idéal pour des études longitudinales de la réponse aux médicaments car il permet aux enquêteurs de suivre les cellules individuelles et leurs destins ainsi que l'ensemble de la population. Variabilité dans la réponse aux médicaments au sein d'une population de cellules est un enjeu majeur pour la conception thérapeutique anti-cancer. Le suivi longitu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Materials
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
| etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
| selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
| Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
| 5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
| multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
| Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon laser launch | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |
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