모델 시아 노 박테리아 종의 표시 및 Markerless 돌연변이의 생성

요약

시아노박테리아에 여러 게놈 변형을 도입하는 것은 산업 및 기초 연구 목적을 위한 균주 개발에 필수적인 도구입니다. 우리는 모델 시아노박테리아 종 Synechocystis sp. PCC6803에서 표시되지 않은 돌연변이와 Synechococcus sp. PCC7002에서 표시된 돌연변이를 생성하는 시스템을 설명합니다.

초록

시아노박테리아는 생태학적으로 중요한 유기체이며 바이오 연료 및 유용한 산업 제품 생산을 위한 잠재적인 플랫폼입니다. 시아노박테리아, 특히 Synechocystis sp. PCC6803 및 Synechococcus sp. PCC7002와 같은 모델 유기체의 유전자 조작은 기초 및 응용 연구 모두를 위한 핵심 도구입니다. 항생제 내성 카세트(하나 이상의 유전자를 포함하는 조작 가능한 DNA 단편)를 삽입하여 염색체 변형을 균주에 도입한 다음 음성 선택 가능한 마커를 사용하여 이 카세트를 제거하는 것은 특히 강력한 기술입니다. 표시되지 않은 돌연변이는 반복적으로 유전적으로 조작될 수 있으며, 원하는 만큼 균주에 많은 변형이 도입될 수 있습니다. 또한, 돌연변이된 균주에서 항생제 내성 단백질을 암호화하는 유전자가 없다는 것은 항생제 내성 유기체가 환경으로 '탈출'할 가능성을 피하기 때문에 바람직합니다. 그러나 시아노박테리아의 반복적인 유전자 조작에 대한 자세한 방법은 과학 문헌에 잘 설명되어 있지 않습니다. 여기에서 우리는 이 기술에 대한 포괄적인 설명을 제공하며, 이 기술에 대한 포괄적인 설명을 제공하여 다중 결실, 관심 유전자 내 단일 지점 돌연변이 및 새로운 유전자 카세트를 삽입하는 돌연변이를 생성하는 데 성공적으로 사용했습니다.

서론

시아 노 박테리아는 지구상의 거의 모든 자연 환경에서 발견되는 박테리아의 진화 고대하고 다양한 문이다. 해양 생태계에서 그들은 특히 풍부 탄소 고정 ^(1)의 약 절반, 바다에서의 질소 고정 ^2와 탄화수소 생산 ³ 톤의 수억의 대부분이 매년 회계, 많은 영양주기에 중요한 역할을한다. 엽록체, 진핵 조류와 식물의 광합성을 담당하는 세포 기관은 숙주 생물체 ^(4)에 의해 침몰 된 cyanobacterium에서 진화 한 것으로 보인다. 시아 노 박테리아는 식물에 보존되어 많은의 광합성, 전자 수송층 ⁽⁵⁾ 및 생화학 적 경로의 연구에 유용한 모델 생물을 증명했다. 추가 시아 노 박테리아에서 점점 그들의 안녕에 전기 ⁷ 및 산업용 화합물을, ^{6 바이오} 연료, 식량 생산을 위해 ^8을 사용하고 있습니다물과 CO _2의 ghly 효율적으로 변환 태양 에너지 ^(9)를 사용하여 바이오 매스합니다. 많은 종은 잠재적으로 농업 생산에 영향을주지 않고 큰 규모로 성장시킬 수있는 시아 노 박테리아를 제안, 최소한의 영양분과 해수와 비 경작지에 재배 할 수있다. 어떤 종은 항진균, 항균 및 항암 화합물 ^{10, 11를....}

프로토콜

문화 미디어 1. 준비

1. Castenholz 1988 년 ^(17)에 따라 BG11 매체를 준비합니다.
   1. 요소와 철 재고 (표 1)를 추적, 100 배 BG11의 재고 솔루션을 준비합니다.
   2. 인산 재고 별도의 용액을 준비 나 ₂ CO ₃ 스톡, N - [트리스 (히드 록시 메틸) 메틸] 아미노 에탄 술폰산 (TES) _{버퍼의 NaHCO3} (표 1).
   3. 인산염과 나 ₂ CO ₃ 주식을 압력솥. - 필터 소독 0.2 μm의 _{필터의 NaHCO3를} TES는 버퍼합니다.
   4. 물 976 ㎖, 100X BG11 10 ㎖, 철분 재고 한 미량 원소 용액 1 ㎖에 결합하여 BG11을 제조하고, 용액을 오토 클레이브. 이 용액을 실온으로 냉각 한 후에 포스페이트 스톡 1 ㎖, 나 ₂ CO ₃ 스톡 1 _{㎖의 NaHCO3} 및 10 ㎖를 추가한다.
   5. BG11 고체 배지를 들어, 한천 15g을 하나의 FLA에 물 700 mL로 추가SK. 제 플라스크에 나트....

결과

플라스미드 설계는 모두 표시되고 표시되지 않은 돌연변이 체의 생성에 성공에 중요하다.도 1 플라스미드 (A)의 일례를 제공하고 B는 스티스 유전자 cpcC1 및 cpcC2 ¹³ 결실 돌연변이 체의 생성에 사용. 각 경우에 5 '및 3'플 랭킹 영역은 약 900-1,000 염기쌍이다. 우리가 성공적으로 상용화에 박차를 가하고있는 최소 약 500 bp의 하였지만 감소 측면 영역을 사용할 수있다. B 플라스미드는 5 '및 3'~ 1킬로바이트 측면 영역 또는 천연 유전자 서열의 변형 된 버전 사이의 유전자 카세트를 포함 할 수있다.

토론

표시되지 않은 돌연변이의 발생에 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1)주의 플라스미드 디자인은 대상 지역이 변경 될 수 있도록; 2) 샘플 자당에, 특히 배양 무균 유지 보장; 3) 도금 처음에 24 시간 이상 한천 플러스 항생제 첨가하여 항생제, 부족 BG11 아가 플레이트 상에 표시 돌연변이 생성 세포를 형질 전환; 4) 배양은 BG11 플러스 자당 한천 플레이트에 도금하기 전에 4 완전 일 돌연변이 표시 : 5)로 표시 돌연변이가 완전히 분리 된 것을 보장하고 6) 완전히 돌연변이 균주의 유전자형을 확인. 이 마지막 단계에서, 삭제 된 영역의 일부를 증폭하기위한 프라이머의 추가는 그것을 제거되었음을 확인하기 위해 사용될 수있다. 서던 블롯은 힘든 상태도 사용될 수있다. 그러나, 우리의 경험은이 문서에서 설명하는 절차는 돌연변이의 적절한 검증을위한 충분한 것입니다. 이 절차는 또한 Synechococ의 현저한 돌연변이를 생성하기 위해 사용되어왔다기분이야 elongatus PCC7942. 그러나,이 cyan.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NaNO3	Sigma	S5506
MgSO4.7H2O	시그마	230391
CaCl2	Sigma	C1016
구연산	Sigma	C0759
Na2EDTA	Fisher	EDT002
H3BO3	Sigma	339067
MnCl2.4H2O	Sigma	M3634
ZnSO4.7H2O	Sigma	Z4750
Na2MoO4.2H2O	시그마	331058
CuSO4.5H2O	시그마	209198
Co(NO3)2.6H2O	시그마	239267
구연산 철 암모늄	Sigma	F5879
K2HPO4	시그마	P3786
Na2CO3	Fisher	SODC001
TES	시그마	T1375
NaHCO3	Fisher	SODH001
HEPES	시그마	H3375
시아노코발라민	시그마	47869
Na2S2O3	Sigma	72049
Bacto 한천	BD	214010
설탕	Fisher	SUC001
페트리 접시 90mm 트리플 벤트	Greiner	633185
0.2 µ m 필터	Sartorius	16534
100 ml 원뿔형 플라스크	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38  m	Bemis	FIL003
Phusion 고충실도 DNA 중합효소	Phusion	F-530
Agarose	Melford	MB1200
DNA 정제 키트	MoBio	12100-300
제한 엔도뉴클레아제	NEB
T4 리가제	Thermo Scientific	EL0011
Luria Bertani 육수	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Kanamycin sulfate	Sigma	60615
Ampicillin	Sigma	A9518
GeneJET 플라스미드 miniprep kit	Thermo Scientific	K0503
14 ml round-bottom tube	BD falcon	352059
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
425-600 µ m 유리 구슬	Sigma	G8772
글리세롤	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
형광 전구	Gro-Lux	69
HT multitron photobioreactor	Infors