Разработка Этанол-индуцированной фиброзных модели печени в данио рерио для изучения прогениторных клеток-гепатоцитов опосредуется Регенерация
Summary
Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.
Abstract
Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.
Introduction
Несмотря на замечательные способности к регенерации гепатоцитов 1, которые являются основным типом клеток паренхимы печени, хронической печеночной недостаточности снижает эту способность, что приводит к печеночной клеток – предшественников (HPC) , зависящему регенерации 2.
Хроническое повреждение печени в основном происходит от злоупотребления алкоголем, хронического вируса гепатита С (ВГС) инфекции 3 и безалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) 4. Это приводит к устойчивому фиброза печени, что связано с накоплением внеклеточного матрикса (ECM) белков. Упорно накопление ECM искажает неповрежденную печеночную архитектуру путем формирования фиброзной рубцовой ткани 5, впоследствии приводит к циррозу печени с высокой заболеваемостью и смертностью. Много попыток было сделано , чтобы смягчить фиброзную реакцию , главным образом, сосредоточив внимание на ингибировании профиброгенных цитокины и активированные миофибробласты 6. Последнее в первую очередь получают из звездчатых клеток печени (НSCS), принцип печени не-паренхиматозные клетки , ответственные за формирование рубцовой печени 4. Тем не менее, регенеративной терапии, которые стимулируют эндогенные клеточные источники, включая HPCS для регенерации гепатоцитов в присутствии устойчивых фиброгенных оскорблений ожидают дальнейшего расследования.
Многие экспериментальные модели фиброза печени были описаны у млекопитающих. Повторные инъекции четыреххлористого углерода (CCl 4) широко используется для индукции фиброза печени у мышей и крыс моделей 7. В сочетании с высоким содержанием жиров (HF) диеты, алкоголь привело к существенному усилению активности профиброгенного экспрессии генов и фиброза печени 8. В то время как стеатоз (липидный накопление) является результатом острого воздействия алкоголя, он делает печень восприимчивой к более тяжелой печеночной травмы 9.
Данио, Danio rerio, стала бесценным позвоночного модельной системы для изучения регенерации. Хотьдругие низшие позвоночные , такие как тритонов и аксолотлей обладают замечательной способностью к регенерации, то данио имеет преимущества по сравнению с другими системами модели в отношении стратегии генной инженерии и визуализации , необходимых для манипулирования потенциальной регенерирующим факторов 10. Данио также представляет собой привлекательную модель для изучения позвоночное алкогольные заболевания печени (ALD) путем простого добавления этанола (этанол) в их воде. Острое воздействие этанола личинок и взрослых данио причиной стеатоз печени 11-13. Когда взрослые данио получил расширенную экспозицию этанола, отложение коллагена наблюдалось с повышающей регуляции фиброзом связанных генов 14. Тем не менее, существует необходимость разработки моделей для изучения регенерации печени в ответ на этаноле в качестве фиброгенным стимула.
В последнее время мы разработали этанол-индуцированной фиброзной модель печени у данио 15. Мы объединили гепатоцитов конкретной системы генетической абляции с лечением в смеси этанол личинками и ADULт данио. Мы создали два трансгенных линий, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 и Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, в котором Е. coli нитроредуктаза (NTR) слиты с бирюзового и mCherry флуоресцентного белка, соответственно, под контролем гепатоцитов специфических жирных кислот связывающего белка 10А, печени основной (fabp10a) промотор. В этой системе, НТР преобразует нетоксичное пролекарство метронидазола (MTZ) в ДНК между прядей сшивающего агента 16, вызывая явную гибель гепатоцитов. Используя эту модель, мы показали, что популяция клеток печени, которые реагируют на передачу сигналов Notch, преобразованный в гепатоциты в ближайшем отсутствии гепатоцитов и в избытке ECM. Мы обозначены эти клетки в качестве HPCS. Кроме того, с помощью химических экранов, мы идентифицировали молекулы активаторы малые передачи сигналов Wnt и ингибиторы передачи сигналов Notch, которые усиливают регенерацию гепатоцитов в печени фиброзной. Therefoповторно, наша фиброзных модель печени в данио представляет собой превосходную химическую систему скрининга по сравнению с клеточной или системы с учетом культурных скрининга млекопитающих на основе. Она представляет собой систему в естественных условиях со значительным с точки зрения затрат и экономии времени преимущества. Здесь мы опишем подробные процедуры для создания фиброзной модель печени EtOH-индуцированных и для осуществления химических экранов с использованием этой модели в данио. Кроме того, анализ времени курса были проведены, чтобы исследовать, как гепатоцитов регенерации происходит в печени фиброзной. Этот протокол обеспечит бесценным инструментом для изучения механизмов и стратегий усиления регенерации гепатоцитов в печени фиброзной.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы наблюдали ГПЦ-опосредованной гепатоцитов регенерации в EtOH / MTZ обработанных выздоравливающих печенью, предполагая, что даже при наличии значительного количества белков ЕСМ в том числе типа фибриллярный коллаген I, то HPCS сохраняют свою правомочность регенерировать в гепатоцитах. MTZ ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана грантами от GTEC (2731336 и 1411318), НИЗ (K01DK081351) и НФС (1354837) в CHS Мы благодарим Alem Гиоргис за критическое прочтение рукописи.
Materials
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75×25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresent microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
- Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
- Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
- Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
- Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
- Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
- Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
- Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective ‘pacemaker’ current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
- Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
- Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
- Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
- Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
- Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
- Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
- Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).
