Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration
Summary
Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.
Abstract
Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.
Introduction
Trotz der bemerkenswerten Regenerationsfähigkeit von Hepatozyten 1, die die Haupt Parenchymzelle Typ der Leber sind, beeinträchtigt chronischem Leberversagen diese Fähigkeit, die zu Lebervorläuferzellen (HPC) -abhängigen Regeneration 2.
Chronische Leberschäden wird hauptsächlich durch Alkoholmissbrauch, chronische Hepatitis – C – Virus (HCV) -Infektion 3 und nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) 4 abgeleitet. Es führt zu einer nachhaltigen Leberfibrose, die mit der Akkumulation von extrazellulären Matrix (ECM) Proteinen assoziiert ist. Persistierende ECM Akkumulation verzerrt intakte Leber Architektur durch ein faseriges Narbengewebe 5 bilden, anschließend in Zirrhose mit hoher Morbidität und Mortalität führt. Viele Versuche sind unternommen worden , um die fibrotische Reaktion zu mildern , die hauptsächlich durch die Konzentration auf die Hemmung profibrogenen Zytokine und aktiviert Myofibroblasten 6. Letztere wird in erster Linie, abgeleitet von hepatischen Sternzellen (HSCs) das Prinzip der Leber nicht parenchymalen Zellen verantwortlich für die Leber Narbenbildung 4. Dennoch regenerative Therapien, die endogenen zellulären Quellen, einschließlich HPCs stimulieren Hepatozyten in Gegenwart von anhaltender fibrogen Beleidigungen erwarten eine weitere Untersuchung zu regenerieren.
Viele experimentelle Modelle der Leberfibrose wurde in Säugetieren beschrieben. Repetitive Injektion von Kohlenstofftetrachlorid (CCl 4) wurde in großem Umfang verwendet , um Leberfibrose in Maus- und Rattenmodelle 7 induzieren. Wenn sie mit einem hohen Fett (HF) Diät kombiniert, führte Alkohol zu einer wesentlichen Heraufregulierung von profibrogenen Genexpression und Leberfibrose 8. Während Steatose (Fettansammlung) von einer akuten Alkoholexposition führt, macht es die Leber anfällig für mehr schwere Leberschädigung 9.
Der Zebrabärbling, Danio rerio, hat sich als eine unschätzbare wirbelModellSystem entstand Regeneration für das Studium. Obwohlanderen niederen Wirbeltiere wie Molche und Axolotl haben eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Regeneration, die Zebrabärbling hat Vorteile gegenüber anderen Modellsystemen in Bezug auf die Genmanipulation und Visualisierungsstrategien benötigt Potenzial regenerativer 10 Faktoren zu manipulieren. Der Zebrafisch stellt auch ein attraktives Vertebraten Modell für die Untersuchung alkoholische Lebererkrankung (ALD) durch einfaches Hinzufügen von Ethanol (EtOH), um ihr Wasser. Akute EtOH Exposition gegenüber Larven und erwachsenen Zebrafisch verursacht Hepatosteatose 13.11. Bei Erwachsenen Zebrabärbling erweiterten EtOH Belichtung erhalten, Kollagenablagerung wurde mit upregulation der Fibrose im Zusammenhang mit Genen 14 beobachtet. Es besteht jedoch ein Bedarf für die Entwicklung Modelle Leberregeneration in Reaktion auf EtOH als fibrogene Stimulus zu studieren.
Vor kurzem haben wir eine EtOH-induzierten fibrotischen Lebermodell in Zebrabärbling 15. Wir kombiniert, um eine Hepatozyten-spezifischen genetischen Ablationssystem mit EtOH Behandlung in Larven- und adult Zebrabärbling. Wir erzeugten zwei transgenen Linien, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 und Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, in denen E.coli Nitroreduktase (NTR) zu dem cyan fusioniert sind und mCherry fluoreszierendes Protein jeweils unter der Kontrolle der Hepatozyten-spezifischen Fettsäure – bindendes Protein 10a, Leber einfach (fabp10a) Promotor. In diesem System wandelt NTR eine nicht – toxische Prodrug Metronidazol (MTZ) in eine DNA Interstrang-Vernetzungsmittel 16, expliziter Tod von Hepatozyten zu induzieren. Mit diesem Modell haben wir gezeigt, dass eine Population von Leberzellen, die Signalisierungs Notch ansprechen, umgewandelt in Hepatozyten in naher Abwesenheit von Hepatozyten und im Überschuß von ECM. Wir bezeichneten diese Zellen als HPCs. Darüber hinaus wird durch chemische Bildschirme identifizierten wir kleine Molekül Aktivatoren der Wnt-Signal und Inhibitoren der Notch-Signalweg, die Hepatozyten-Regeneration in der fibrotischen Leber vermehren. Therefore, unser fibrotischen Lebermodell in Zebrabärbling stellt ein hervorragendes System chemisches Screening im Vergleich zu Zellkultur- oder Säugetier-basierte Screening-System. Es ist ein in vivo – System mit erheblichen Kosten- und zeitsparende Vorteile. Hier beschreiben wir die Einzelheiten der Verfahren zur Herstellung einer EtOH-induzierten Modell fibrotischen Leber und zur Durchführung chemischer Bildschirme unter Verwendung dieses Modells in Zebrabärbling. Darüber hinaus wurden der zeitliche Verlauf Analysen wie Hepatozyten Regeneration in der fibrotischen Leber auftritt, zu untersuchen durchgeführt. Dieses Protokoll wird ein unschätzbares Werkzeug zur Verfügung stellen, die Mechanismen und Strategien zur Verbesserung Hepatozyten Regeneration in der fibrotischen Leber zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beobachteten HPC-vermittelte Hepatozyten Regeneration in den EtOH / MTZ-behandelten Rückgewinnung Lebern, was nahe legt, dass selbst in Gegenwart von erheblichen Menge an ECM-Proteinen, einschließlich fibrillärem Kollagen Typ I, die HPCs ihre Kompetenz behalten als Hepatozyten zu regenerieren. Die MTZ nur Behandlung nicht zu einer Erhöhung der Abscheidung von ECM – Proteine signifikant, während die EtOH nur Behandlung nicht HPC Aktivierung 15 induzieren. Durch die Nutzung der kombinierten EtOH …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus der GTEC (2731336 und 1411318), der NIH (K01DK081351) und der NSF (1.354.837) zu CHS unterstützt Wir Alem Giorgis für das kritische Lesen des Manuskripts danken.
Materials
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75×25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresent microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
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