前駆細胞が媒介する肝細胞の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発
Summary
Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.
Abstract
Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.
Introduction
肝臓の主要な実質細胞型である肝細胞1、の顕著な再生能力にもかかわらず、慢性肝不全、肝前駆細胞（HPC）依存性再生2につながる、この能力を損ないます。
慢性肝障害は、主にアルコールの乱用、慢性C型肝炎ウイルス（HCV）感染3及び非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）4から誘導されます。それは、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の蓄積に関連している持続的な肝線維症につながります。永続化ECMの蓄積はその後、高い罹患率と死亡率との肝硬変で、その結果、線維性瘢痕組織5を形成することにより、無傷の肝アーキテクチャを歪めます。多くの試みがprofibrogenicサイトカインおよび活性化筋線維芽細胞6を阻害することに焦点を当て、主に線維化反応を緩和するために行われてきました。後者は主にH（肝星細胞に由来しますSCS）、肝臓の瘢痕形成4に責任原則肝非実質細胞。それにもかかわらず、持続的な線維形成侮辱の存在下で肝細胞を再生成するのHPCを含む内因性の細胞源を刺激する再生治療は、さらなる調査を待ちます。
肝線維症の多くの実験モデルは、哺乳動物において記載されています。四塩化炭素（CCl 4）の繰り返し注射が広くマウスおよびラットモデル7における肝線維症を誘導するために使用されてきました。高脂肪（HF）ダイエットと組み合わせると、アルコールはprofibrogenic遺伝子発現と肝線維症8の実質的なアップレギュレーションにつながりました。脂肪症（脂質蓄積）が急性アルコール暴露から生じるが、それはより重度の肝損傷9に肝臓が受けやすくなります。
ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは、再生を研究するための貴重な脊椎動物モデル系として浮上しています。しかしこのようなイモリやアホロートルなどの他の下等脊椎動物は、再生のための驚くべき能力を持っている、ゼブラフィッシュは、潜在的な回生要因10を操作するために必要な遺伝子操作と可視化戦略に関して、他のモデル系を超える利点を有しています。ゼブラフィッシュは、単にそれらの水エタノール（エタノール）を添加してアルコール性肝疾患（ALD）を研究するための魅力的な脊椎動物モデルを表します。幼虫と大人のゼブラフィッシュへの急性エタノール曝露は、肝臓脂肪症11-13を引き起こしました 。成体ゼブラフィッシュは、拡張エタノール曝露を受けたときに、コラーゲン沈着は、線維症関連遺伝子14のアップレギュレーションを観察しました。ただし、必要が線維形成刺激としてのEtOHに応じて、肝臓の再生を研究するためのモデルを開発するために存在します。
最近、我々はゼブラフィッシュ15におけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルを開発しました。私たちは、幼虫とADULにエタノール治療と肝細胞特異的遺伝子除去システムを組み合わせましたトンのゼブラフィッシュ。我々は2つのトランスジェニック系統を生成し、Tgは（fabp10a：CFP-NTR）GT1及びTg（fabp10a：mCherryを-NTR）GT2、 大腸菌ニトロレダクターゼ（NTR）が制御の下で、それぞれシアン、mCherryを蛍光タンパク質に融合されています肝細胞特異的な脂肪酸のタンパク質10aは結合、肝臓基本 （fabp10a）プロモーター。このシステムでは、NTRは、肝細胞の明示的な死を誘導する、DNAストランド間架橋剤16に非毒性のプロドラッグメトロニダゾール（MTZ）に変換します。このモデルを使用して、我々は、Notchシグナル伝達に応答する肝細胞の集団は、肝細胞の近くにない場合およびECMを超える肝細胞に変換することを実証しました。私たちは、HPCのように、これらの細胞を指定しました。さらに、化学画面を、我々は線維症、肝臓における肝細胞の再生を増強する小分子Wntシグナル伝達の活性化剤およびNotchシグナル伝達の阻害剤を同定しました。 Therefo再は、ゼブラフィッシュにおける当社の線維性肝臓モデルは、セルculture-または哺乳動物に基づくスクリーニングシステムと比較して、優れた化学的スクリーニングシステムを表します。これは、かなりの費用と時間節約のメリットとin vivo系です。ここでは、エタノール誘発性線維症肝臓モデルを確立するためのゼブラフィッシュでは、このモデルを用いて化学スクリーンを実行するための詳細な手順を説明します。また、経時的分析は、肝細胞の再生が線維性肝臓で発生方法の検討を行いました。このプロトコルは、線維性肝臓で肝細胞の再生を促進するメカニズムと戦略を研究するための貴重なツールを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちも、私はコラーゲン線維状の型を含むECMタンパク質の実質的な量の存在下では、HPCのが肝細胞として再生するために自分の能力を保持していることを示唆し、エタノール/ MTZ-扱わ回復肝臓におけるHPC媒介肝細胞の再生を観察しました。エタノールのみ処理はHPCの活性化15を誘導しなかったMTZのみ処理は、大幅にECMタンパク質の沈着を増加させませんでした。合わせたエタノール…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、私たちは、原稿の重要な読書のためのアレムGiorgisに感謝CHSにGTEC（2731336および1411318）、NIH（K01DK081351）、およびNSF（1354837）からの助成金によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75×25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresent microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
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