Desenvolvimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra para estudar Progenitor mediada por células de regeneração de hepatócitos
Summary
Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.
Abstract
Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.
Introduction
Apesar da notável capacidade de regeneração de hepatócitos 1, que são o tipo de célula parenquimatosa grande do fígado, insuficiência hepática crónica prejudica essa capacidade, levando a célula progenitora hepática (HPC) regeneração dependente 2.
Lesão hepática crônica é essencialmente derivada de abuso de álcool, o vírus da hepatite C crônica (HCV) 3 e doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) 4. Ele conduz a fibrose do fígado sustentada, que está associada com a acumulação de proteínas da matriz extracelular (ECM). Persistindo acumulação ECM distorce a arquitetura hepática intacta através da formação de um tecido fibroso de cicatriz 5, posteriormente, resultando em cirrose com alta morbidade e mortalidade. Muitas tentativas têm sido feitas para reduzir a resposta fibrótica, principalmente, concentrando-se em inibir citocinas profibrogenic e miofibroblastos activados 6. Este último é derivado principalmente de células estreladas hepáticas (HSCs), as células não-parenquimatosas hepáticas responsáveis principais para a formação de cicatriz hepática 4. No entanto, as terapias de regeneração que estimulam fontes celulares endógenos, incluindo HPCs para regenerar hepatócitos na presença de insultos fibrogênicas sustentados aguardam uma investigação mais aprofundada.
Muitos modelos experimentais de fibrose hepática foram descritos em mamíferos. Injecção repetida de tetracloreto de carbono (CCl 4) tem sido amplamente utilizado para induzir a fibrose do fígado em modelos de rato e de murino 7. Quando combinado com uma dieta de elevado teor de gordura (HF), álcool levou a uma regulação positiva da expressão do gene substancial profibrogenic e fibrose hepática 8. Enquanto esteatose (acumulação de lípidos) resulta da exposição aguda do álcool, faz o fígado suscetível a lesões hepáticas mais graves 9.
O peixe-zebra, Danio rerio, tem emergido como um inestimável sistema modelo para o estudo de vertebrados regeneração. Emboraoutros vertebrados inferiores, tais como tritões e axolotls têm uma notável capacidade de regeneração, o peixe-zebra tem vantagens sobre outros sistemas modelo em relação às estratégias de manipulação genética e visualização necessários para manipular potencial regenerativo fatores 10. O peixe-zebra também representa um modelo atractivo para estudar vertebrado doença hepática alcoólica (ALD) pela simples adição de etanol (EtOH) para a água. A exposição aguda EtOH para peixe-zebra larval e adulto causada esteatose hepática 11-13. Quando peixe-zebra adulto recebeu a exposição EtOH estendida, deposição de colágeno foi observada com a regulação positiva de genes relacionados à fibrose 14. No entanto, existe uma necessidade para o desenvolvimento de modelos para estudar a regeneração do fígado em resposta a um estímulo de EtOH como fibrogênica.
Recentemente, desenvolvemos um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra 15. Nós combinados um sistema de ablação genética específicos de hepatócitos com o tratamento de EtOH em larvas e adult de peixe-zebra. Geramos duas linhagens transgênicas, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 e Tg (fabp10a: mCherry-NTR) gt2, no qual E.coli nitro-redutase (NTR) são fundidos ao ciano e proteína fluorescente mCherry, respectivamente, sob o controle do ácido graxo específico do hepatócito de ligação 10a proteína, fígado básico (fabp10a) promotor. Neste sistema, NTR converte um pró-f ármaco não tóxico metronidazol (MTZ) num ADN agente de reticulação inter-cadeia 16, induzir a morte explícita dos hepatócitos. Utilizando este modelo, foi demonstrado que uma população de células hepáticas, que respondem à sinalização de Notch, convertido em hepatócitos na quase ausência de hepatócitos e o excesso de ECM. Nós designado essas células como HPCs. Além disso, através de telas químicas, identificamos pequenas ativadores de moléculas de sinalização Wnt e inibidores da sinalização Notch que aumentam a regeneração de hepatócitos no fígado fibrótico. Therefore, o nosso modelo de fígado fibrótico no peixe-zebra representa um sistema de triagem química excelente em comparação com cultura- celular ou sistema de triagem de mamíferos-based. É um sistema in vivo, com custo significativo e benefícios de economia de tempo. Aqui nós descrevemos os procedimentos detalhados para o estabelecimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol e para a realização de telas químicos usando este modelo no peixe-zebra. Além disso, foram realizadas análises de tempo-curso para investigar a forma como a regeneração de hepatócitos no fígado ocorre fibrótica. Este protocolo irá fornecer uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos e estratégias de reforço de hepatócitos regeneração no fígado fibrótico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Observamos mediada por HPC regeneração de hepatócitos no fígado recuperando-tratada MTZ EtOH /, sugerindo que, mesmo na presença de uma quantidade substancial de proteínas de ECM, incluindo o tipo I fibrilar colagénio, os HPCs conservam a sua competência para regenerar como hepatócitos. A única MTZ-tratamento não aumentar a deposição das proteínas da MEC significativamente, ao passo que o único tratamento EtOH não induziu activação de HPC 15. Ao utilizar o tratamento combinado de EtOH / MTZ,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte por doações do GTEC (2731336 e 1411318), o NIH (K01DK081351), ea NSF (1.354.837) para CHS Agradecemos Alem Giorgis para a leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75×25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresent microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
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