Utveckling av en etanol-inducerad Fibrotisk Lever modell i Zebrafish att studera stamceller-medierad Hepatocyte Regeneration
Summary
Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.
Abstract
Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.
Introduction
Trots den anmärkningsvärda regenereringskapacitet hepatocyter 1, som är den huvudsakliga parenkymal celltyp av levern, försämrar kronisk leversvikt denna förmåga, vilket leder till lever stamcellstransplantation (HPC) -beroende förnyelse 2.
Kronisk leverskada härrör huvudsakligen från alkoholmissbruk, kronisk hepatit C-virus (HCV) 3 och alkoholfria fettlever (NAFLD) 4. Det leder till ihållande leverfibros, som är associerad med ackumuleringen av extracellulära matrix (ECM) -proteiner. Ihållande ECM ackumulering snedvrider intakt lever arkitektur genom att bilda en fibrös ärrvävnad 5 senare resulterar i cirros med hög sjuklighet och dödlighet. Många försök har gjorts för att mildra den fibrotiska svar främst genom att fokusera på att hämma profibrogenic cytokiner och aktiverade myofibroblaster 6. Det senare är främst härrör från leverstel celler (HSCS), principen lever icke-parenkymala celler som ansvarar för lever ärrbildning 4. Ändå regenerativa terapier som stimulerar endogena cellulära källor inklusive HPC att regenerera leverceller i närvaro av ihållande fibrogena förolämpningar väntar ytterligare utredning.
Många experimentella modeller av leverfibros har beskrivits i däggdjur. Repetitiv injektion av koltetraklorid (CCI4) har använts i stor utsträckning för att framkalla leverfibros i murina och råttmodeller 7. När de kombineras med en fettrik (HF) diet, alkohol lett till en betydande uppreglering av profibrogenic genexpression och leverfibros 8. Medan leversteatos (fettinlagring) resultat från alkohol exponering akut, det gör levern mottagliga för mer allvarlig leverskada 9.
Zebrafisk, Danio rerio, har dykt upp som en ovärderlig ryggradsdjur modellsystem för att studera förnyelse. Fastandra lägre ryggradsdjur, såsom vattensalamandrar och axolotl har en anmärkningsvärd förmåga för regenerering, zebrafisk har fördelar jämfört med andra modellsystem när det gäller de genen manipulation och visualisering strategier som behövs för att manipulera potentiella regenerativ faktorer 10. Zebrafisk representerar också en attraktiv ryggradsdjur modell för att studera alkoholrelaterad leversjukdom (ALD) genom att helt enkelt lägga etanol (EtOH) till deras vatten. Akut EtOH exponering för larver och vuxna zebrafisk orsakade leversteatos 11-13. När vuxna zebrafisk fått utökad EtOH exponering, var kollagenavsättning observerades med uppreglering av fibros relaterade gener 14. Emellertid föreligger ett behov av att utveckla modeller för att studera leverregenerering i beroende av EtOH som ett fibrinogena stimulus.
Nyligen har vi utvecklat en EtOH-inducerad fibrotisk lever modell i zebrafisk 15. Vi kombinerat en hepatocyt-specifik genetisk ablation systemet med EtOH behandling i larv och adult zebrafisk. Vi genererade två transgena linjer, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 och Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, där E. coli nitroreduktas (NTR) är sammansmält med cyan och mCherry fluorescerande protein, respektive, under kontroll av hepatocyt-specifika fettsyrabindande protein 10a, lever basic (fabp10a) promotor. I detta system, NTR omvandlar en icke-toxisk prodrug metronidazol (MTZ) i en DNA-inter-strängtvärbindningsmedel 16, vilket inducerar explicit död av hepatocyter. Med hjälp av denna modell, visade vi att en population av leverceller, som är mottagliga för Notch-signalering, omvandlas till hepatocyter i den praktiskt taget obefintliga hepatocyter och överskottet av ECM. Vi betecknas dessa celler som HPC. Vidare genom kemiska skärmar, identifierade vi småmolekylära aktivatorer av Wnt signalering och hämmare av Notch-signalering som utökar hepatocyte förnyelse i fibrotisk lever. Therefore, vår fibrotisk lever modell i zebrafisk är en utmärkt kemisk screening system jämfört med cell kultur- eller däggdjursbaserad screening systemet. Det är ett system för med betydande kostnads- och tidsbesparande fördelar in vivo. Här beskriver vi de detaljerade förfaranden för att upprätta en EtOH-inducerad fibrotisk lever modell och för att utföra kemiska skärmar som använder denna modell i zebrafisk. Vidare har tidsförloppet analyser för att undersöka hur hepatocyt förnyelse sker i fibrotisk lever. Detta protokoll kommer att ge ett ovärderligt verktyg för att studera mekanismer och strategier för att förstärka hepatocyte förnyelse i fibrotisk lever.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi observerade HPC-medierad hepatocyt regenere i EtOH / MTZ-behandlade återhämtar levrar, vilket tyder på att även i närvaro av betydande mängd ECM-proteiner inklusive fibrillärt kollagen typ I, de HPC bibehåller sin kompetens för att regenerera som hepatocyter. Den MTZ endast behandling ökade inte avsättning av ECM-proteiner avsevärt, medan EtOH enda behandling inte framkalla HPC aktivering 15. Genom att använda den kombinerade EtOH / MTZ behandling, kunde vi undersöka HPC driven regenere i fib…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av bidrag från GTEC (2731336 och 1411318), NIH (K01DK081351), och NSF (1.354.837) till CHS Vi tackar Alem Giorgis för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75×25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresent microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
- Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
- Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
- Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
- Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
- Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
- Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
- Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective ‘pacemaker’ current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
- Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
- Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
- Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
- Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
- Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
- Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
- Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).
