Zebrafish의에서 에탄올에 의한 섬유 성 간 모델의 개발은 전구 세포 매개 간세포의 재생을 연구하는

Summary

과도한 세포외 기질 단백질의 침착으로 인한 지속적인 섬유화는 간경변증을 유발합니다. 알코올 남용은 심각한 간 질환의 주요 원인 중 하나입니다. 우리는 알코올로 인한 부상 시 간세포 재생을 촉진하는 메커니즘과 전략을 연구하기 위해 에탄올 유도 제브라피시 섬유성 간 모델을 구축했습니다.

Abstract

세포외 기질(ECM) 단백질 축적이 지속되면서 간 섬유화가 지속되면 간의 세포 역량이 상실되어 간세포 기능 장애를 동반한 간경변증이 발생합니다. 여러 가지 간 모욕 중 알코올 남용은 간 기능 부전 및 간세포 암종을 포함한 심각한 건강 문제로 이어질 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 알코올에 반응하여 간세포를 재생하는 내인성 세포 공급원의 정체는 제대로 조사되지 않았습니다. 더욱이, 알코올로 인한 손상에 대한 간세포 재생을 효과적으로 모델링한 연구는 거의 없습니다. 우리는 최근 제브라피시에서 에탄올(EtOH) 유도 섬유성 간 모델을 확립한 것에 대해 보고했는데, 여기서 간전구세포(HPC)는 섬유생성 자극이 있는 상태에서 거의 완전한 간세포 소실 시 간세포를 생성했습니다. 또한, 이 모델을 사용한 화학적 스크리닝을 통해 간세포 재생을 향상시키는 여러 개의 소분자를 확인했습니다. 여기에서는 EtOH 유도 섬유성 간 모델을 개발하고 이 모델을 제브라피시에서 사용하여 화학 스크리닝을 수행하는 절차를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 섬유성 간에서 간세포가 어떻게 재생되는지에 대한 분자 및 세포 메커니즘을 설명하는 중요한 도구가 될 것입니다. 또한, 이러한 방법은 in vivo에서 만성 간 질환에 대한 새로운 치료 전략의 잠재적 발견을 촉진할 것입니다.

Introduction

간 실질 주요 세포 타입 간세포 ^하나의 놀라운 재생 능력에도 불구하고, 만성 간부전 간장 전구 세포 (HPC) ^의존성이 재생 선도,이 능력을 손상시킨다.

만성 간 손상은 주로 알코올 남용, 만성 C 형 간염 바이러스 (HCV) 감염 ⁽³⁾ 및 비 - 알코올성 지방 간 질환 (NAFLD) ^(4)로부터 유도된다. 이 세포 외 기질 (ECM) 단백질의 축적과 연관되어 유지 간 섬유증으로 이끈다. 지속 ECM 축적 이후 높은 이환율과 사망률과 간경변의 결과로, 섬유 반흔 조직 ^(5)을 형성하여 그대로 간 구조를 왜곡. 많은 시도가 profibrogenic 사이토 카인 ^활성을 억제 근섬유 ^6에 초점을 주로 섬유 성 반응을 완화하기 위해 이루어졌다. 후자는 주로 H (간 성상 세포에서 유래희주), 간 흉터 형성 ^(4)에 대한 책임 원칙 간 비 실질 세포. 그럼에도 불구하고, 지속적인 폐의 섬유 성 모욕의 존재 간세포를 재생하는 HPC의 등 내인성 세포 소스를 자극 재생 치료법은 추가 조사를 기다리고 있습니다.

간 섬유화 많은 실험 모델은 포유류....

Protocol

Zebrafish의 제기 및 기술 기관 동물 관리 및 사용위원회의 조지아 연구소의 승인을 국민 건강의 연구소와의 기준을 충족하는 표준 프로토콜을 사용하여 사육 하였다.

솔루션 1. 준비

1. 배아 / 애벌레 제브라 피쉬를 유지하기 위해 (상호 교환 '배아 매체'와 함께 사용) 20 L 계란 물을 준비합니다. 증류수 250 ml의 1.5 g CASO _4, 6 g 즉시 바다 바다 소금을 녹여. 20 L 증류수와 선동으로 가득 찬 상자 속에 든 대형 유리 병에 붓는다.
2. 1 L 준비 1- 페닐 -2- 티오 우레아 (PTU) 스톡 용액 (20 배). 1 L 증류수에 0.6 g의 PTU 분말을 녹여. 작업 용액 0.003 %의 최종 농도로 20 ml의 배아 매체 당 스톡 용액 1 ㎖를 추가한다.
   주의 : PTU는 흡입 또는 피부 노출 다음 전신 독성을 일으킬 수 있습니다. 준비하고 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다.
3. 1 L의 에틸 3- aminobe 준비nzoate 메탄 (Tricaine) 원액 (20 배). 증류수에 4g의 Tricaine 분말을 녹여. 1 M 트리스 완충액 (pH 9)을 첨가하여 pH를 7로 조정하고, 증류수 1 L에 최종 부피를 가져온다. -20 ℃에서 50 ㎖로 나누....

Results

도 1은 유충 지브라 피쉬의 EtOH로 인한 간 섬유화 모델의 개발을 도시한다. 의 EtOH에 제브라 피쉬 애벌레를 노출 프로토콜을 최적화하기 위해, 우리는 먼저 EtOH로 독성을 평가 하였다. 2.5 일 후 - 수정 (DPF) 유충은 동시 24 시간을 EtOH / MTZ 처리 한 다음 24 시간 동안 EtOH 중 농도 1 %, 1.5 %, 2 %를 노출시켰다. 거의 모든 애벌레 콜라겐 등 세포 외 기질 단백질의 희귀 증착 최소한의 폐의 섬유 성 변화를 보여 1 %의 EtOH 이하로 노출 동안 2 %의 EtOH에 노출, 높은 사망률을 일으키는 원인이되었다. 이러한 결과에 기초하여, 유충 24 시간 (2.5-3.5 DPF), 그리고, 동시에 24 시간 (3.5-4.5 DPF) (도 1A)에 대해 MTZ 처리 1.5 % EtOH로 전처리 하였다. 의 EtOH / MTZ 처리 된 유충은 트렁크와 꼬리의 위쪽 곡률,.......

Discussion

우리는 심지어 내가 콜라겐 섬유의 유형을 포함하여 ECM 단백질의 상당한 양의 존재의의 HPC가 간세포로 재생하기 위해 자신의 역량을 유지하는 것이 시사의 EtOH / MTZ 처리 복구 간에서 HPC 매개 간세포의 재생을 관찰했다. 의 EtOH 만 처리는 HPC 활성화 ^(15)를 유도하지 않은 반면, MTZ 전용 치료는 크게 ECM 단백질의 침착을 증가하지 않았다. 조합의 EtOH / MTZ 처리를 이용하여, 우리는 섬유 성 간에서 HPC 기반의 재생을 조사 할 수 있었다. 간세포의 거의 완전한 제거는 HPC 중심의 간세포 재생을 이끌어, 클러스터 NRCS에 의해 간세포 특이 형광의 유무의 기준에 따라 MTZ 처리 유충과 크게 감소 간 볼륨을 정리하는 것이 중요합니다. 동물 수의 음료 또는 intraga을 요구하는 것을 허용 할 필요가 없기 때문에 물고기에서, 길 및 피부의 혈관, 알콜 ^(24)을 흡수포유 동물 모델에서와 같이 STRIC 주입. 우리는 물을 순환하지 않고 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
칼슘 설페이트 헤미하이드레이트 (CaSO4)	Acros	AC385355000
마그네슘 설페이트 (MgSO4)	EMD	MX0075
1,4-피페라진 디에탄설폰산 (PIPES)	시그마-알드리치	P6757
에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)- N,N,N′,N′ -테트라아세트산(EGTA)	시그마-알드리치	E3889
에탄올	시그마-알드리치	E7023	200 프루프
포름알데히드	Fisher Scientific	F79-500
메트로니다졸(MTZ)	시그마-알드리치	M3761
1-페닐-2-티오우레아(PTU)	시그마-알드리치	P7629
3-아미노 벤조산 에틸 에스테르 (트리카인)	Sigma-Aldrich	A5040
인산염 완충 식염수(PBS) 정제	Amresco	E404	1정을 100ml 증류수
디메틸설폭사이드(DMSO)	그마-Aldrich	D2438
소 혈청 알부민	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
저융점 아가로스	Amresco	BP165
줄기세포 신호 화합물 라이브러리	Selleck 화학물질	L2100	10  DMSO
ActiProbe-1K 라이브러리	Timtec	ActiProbe-1K	10  DMSO
SB 415286	Selleck Chemicals	S2729	DMSO로 10  mM
CHIR-99021	Selleck Chemicals	S2924	DMSO로 10  mM
Anti-Collagen I 항체	Abcam	ab23730	면역 염색을 위해 1:100에서 사용, 물고기와 반응
AlexaFluor 647 당나귀 항토끼 IgG (H + L)	분자 프로브	A31573	면역 염색을 위해 1:200에서 사용
마운팅 미디어 (Vectorshield)	Vector Laboratories	H-1400
100 mm 페트리 접시	VWR	25384-088
24-well 플레이트	VWR	10062-896
집게	파인 사이언스 도구	11255-20	Dumont #55
유리 슬라이드	VWR	48312-003	75x25 mm
커버 유리	VWR	48366-045	18 mm
플라스틱 랩	Fisher Scientific	22305654
알루미늄 호일	Fisher Scientific	1213100
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Vibrotome	Leica	VT1000 S
실체 현미경	Leica	M80
Epifluorescentence microscope	Leica	M205 FA
Confocol microscope	Zeiss	LSM700