Generación de células epiteliales de las vías respiratorias del ratón ESC-Obtenido usando Descelularizado pulmón andamios
Summary
Este protocolo dirige eficientemente madre embrionarias de ratón endodermo definitivo derivado de las células de las vías respiratorias para madurar las células epiteliales. Esta técnica utiliza la diferenciación 3 dimensiones andamios pulmonares descelularizados para dirigir especificación linaje de pulmón, en un entorno de cultivo definido, libre de suero.
Abstract
Pulmón diferenciación linaje requiere la integración de las señales ambientales complejos que incluyen el factor de crecimiento de señalización, las interacciones célula-célula y las interacciones célula-matriz. Debido a esta complejidad, la recapitulación del desarrollo del pulmón in vitro para promover la diferenciación de las células madre a las células epiteliales del pulmón ha sido un reto. En este protocolo, los andamios de pulmón descelularizados se utilizan para imitar el entorno de 3 dimensiones del pulmón y generar células epiteliales de las vías respiratorias derivadas de células madre. células madre embrionarias de ratón se diferencian en primer lugar al linaje endodermo utilizando un método de cultivo cuerpo embrioides (EB) con las células del endodermo activina A. continuación, se siembran en los andamios descelularizado y se cultivaron a la interfaz aire-líquido hasta por 21 días. Esta técnica promueve la diferenciación de las células sembradas a las células epiteliales de las vías respiratorias funcional (células ciliadas, células club, y células basales) sin suplementación adicional del factor de crecimiento. Esta configuración se define la cultura, Seru-M libre, barato y reproducible. Aunque no existe una contaminación limitada de linajes endodermo no pulmonares en la cultura, este protocolo sólo genera poblaciones epiteliales de las vías respiratorias y no da lugar a las células del epitelio alveolar. epitelios de las vías respiratorias generados con este protocolo se pueden utilizar para estudiar las interacciones célula-matriz durante la organogénesis de pulmón y para el modelado de la enfermedad o plataformas de descubrimiento de medicamentos de patologías relacionadas con las vías respiratorias, tales como fibrosis quística.
Introduction
Diferenciación dirigida de células pluripotentes a la estirpe de pulmón depende de eventos de señalización precisos en el microambiente 1,2. Debido a la naturaleza dinámica de este proceso que ha sido un reto para imitar los acontecimientos precisos de la organogénesis de pulmón in vitro. Los informes recientes han utilizado estrategias de restricción de linaje por etapas con el factor de crecimiento soluble suplementación de los cultivos de dos dimensiones para lograr la diferenciación de pulmón 3-8. En protocolos de diferenciación por etapas, las células pluripotentes, si las células madre embrionarias (ESC) o células madre pluripotentes inducidas, se diferenciaron primero en la capa de germen de endodermo definitivo. células endodérmicas fueron empujados posteriormente a un destino endodermo anterior y, posteriormente, a las células progenitoras de pulmón, como se identifica por la expresión del factor de transcripción que contiene homeodominio-NKX2-1. Estos progenitores de pulmón se diferenciaron adicionalmente a proximal (vía aérea) o células epiteliales de pulmón distales (alveolares) wiTH continuó suplementos de factores de crecimiento. Tales estrategias de 2 dimensiones han tenido cierto éxito en la generación de las células epiteliales del pulmón, sin embargo, hay varias limitaciones, incluyendo las eficiencias poco claros, la posible contaminación de otros de origen endodérmico, la falta de una estructura de 3 dimensiones (3D), y en algunos casos uso de cultivos indefinidos con suplementos de suero. Cultura de pluripotentes células diferenciadas o en andamios pulmonares descelularizados se utiliza cada vez más como un ensayo para evaluar el potencial regenerativo de las células sembradas en la formación de estructuras epiteliales del pulmón 3,5,6,8,9. Tales informes cultura células sembradas en andamios con factor de crecimiento continuo o de suplementos de suero.
desarrollo de pulmón implica la división, migración, la expresión génica y la diferenciación de las células individuales en respuesta a señales ambientales. La matriz extracelular (ECM) es un entramado de glicoproteínas que además de proporcionar soporte estructural, dirige tissue morfogénesis mediante la integración y la regulación de estos procesos 10,11. Al utilizar el andamio ECM de pulmón como una plataforma natural para la cultura endodermo para imitar mejor el entorno de desarrollo de pulmón in vivo, hemos generado células madre epiteliales de las vías respiratorias derivadas de células en un cultivo definido 3D-ajuste con alta eficiencia y reproducibilidad.
Rata andamios ECM pulmonares fueron generados por descelularización, así como células endodérmicas derivados de ESC de ratón fueron generados y posteriormente sembradas en estos andamios. expresión dual de CXCR4 y proteínas c-KIT indica una identidad celular endodermo definitivo y células positivas tanto para Sox2 y expresión NKX2-1 son identificadas como células de las vías respiratorias (pulmonares proximales) progenitoras. Las células del endodermo definitivo se cultivaron en la interfase aire-líquido (ALI) para un máximo de tres semanas para generar células epiteliales de las vías respiratorias funcional in vitro.
Este protocolo promueve la diferenciación de pulmón linaje de definitiva endodermo a los 7 días, observados con la aparición de NKX2-1 + / + Sox2 progenitores tempranos pulmonares proximales. Para el día 14 y 21 de las poblaciones de células epiteliales de las vías respiratorias maduros cultivo emergen incluyendo ciliadas (TUBB4A +), club (SCGB1A1 +) y células basales con semejanza morfológica y funcional de las vías respiratorias de ratones nativos (+ TRP63, KRT5 +). Este protocolo demuestra la importancia del microambiente 3D de matriz para lograr la diferenciación robusto a las vías respiratorias células epiteliales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí genera epitelios de las vías respiratorias derivadas de CES maduros utilizando sólo los andamios pulmón natural para dirigir la diferenciación con ningún otro suplementación. Esta configuración se define la cultura, y barato, y reproducible libre de suero. No se requiere un factor de crecimiento de la suplementación del medio de diferenciación base. Métodos publicados anteriormente para la generación de células epiteliales de pulmón de células madre derivadas han utilizado estra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deseamos agradecer al Dr. Rossant y el Dr. Bilodeau para el CES mCherry NKX2-1 utilizado en los experimentos representados en las figuras 1-3. FACS se realizó en las instalaciones de SickKids-UHN Citometría de Flujo. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de funcionamiento de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y una subvención de la infraestructura (CSCCD) de la Fundación Canadiense de la Innovación.
Materials
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10U/mL heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90U/mL Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200U/mL penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25μg/mL amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05mg/mL ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
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