تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح
Summary
يصف هذا البروتوكول الخطوات الإجرائية الأساسية لأداء خلية كاملة تسجيلات التصحيح المشبك. هذه التقنية تتيح دراسة السلوك الكهربائي للخلايا العصبية، وعندما أجريت في شرائح الدماغ، تسمح للتقييم مختلف الوظائف العصبية من الخلايا العصبية التي لا تزال متكاملة في الدوائر الكهربائية في المخ الحفاظ عليها بشكل جيد نسبيا.
Abstract
خلية كاملة تسجيل التصحيح، المشبك هو أسلوب الكهربية التي تسمح للدراسة الخواص الكهربية لجزء كبير من الخلايا العصبية. في هذا التكوين، micropipette في اتصال مع ضيق غشاء الخلية، مما يمنع تسرب الحالي، وبالتالي توفر القياسات الحالية الأيونية أكثر دقة من حاد داخل الخلايا طريقة تسجيل الكهربائي المستخدمة سابقا. تقليديا، وتسجيل كامل الخلية لا يمكن أن يؤديها على الخلايا العصبية في أنواع مختلفة من الاستعدادات، بما في ذلك نماذج زراعة الخلايا، الخلايا العصبية فصل الخلايا العصبية في الدماغ شرائح، وفي الحيوانات تخدير أو مستيقظا سليمة. وخلاصة القول، وقد ساهم هذا الأسلوب إلى حد كبير في فهم الخصائص الفيزيائية الحيوية السلبية والإيجابية للخلايا منفعل. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه يوفر معلومات حول كيفية محددة التلاعب (على سبيل المثال، الدوائية،-مجرب يسببها المطاوعة) قد يغير وظائف الخلايا العصبية محددة أو جhannels في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى ذلك، وفتح كبير من غشاء البلازما يسمح الحل ماصة الداخلية لتنتشر بحرية في السيتوبلازم، وتوفير وسيلة لادخال المخدرات، على سبيل المثال، منبهات أو الخصوم من البروتينات داخل الخلايا المحددة، والتلاعب هذه الأهداف دون تغيير وظائفهم في الخلايا المجاورة. أداء هذه المادة سوف تركز على تسجيل كامل الخلية في الخلايا العصبية في الدماغ شرائح، تمهيدا لديه ميزة تسجيل الخلايا العصبية في الدماغ الدوائر الحفاظ عليها بشكل جيد نسبيا، أي في سياق ذي صلة من الناحية الفسيولوجية. على وجه الخصوص، عندما جنبا إلى جنب مع الأدوية المناسبة، وهذا الأسلوب هو أداة قوية تسمح بتحديد neuroadaptations المحددة التي وقعت بعد أي نوع من التجارب، مثل التعلم، والتعرض لتعاطي المخدرات، والإجهاد. وباختصار، تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في شرائح الدماغ توفر وسيلة لقياس في فيفو إعداد تغييرات تستمر فترات طويلةفي وظائف الخلايا العصبية التي وضعت في الحيوانات المستيقظة سليمة.
Introduction
تقنية التصحيح، المشبك، وهي تقنية الكهربية التي تم تطويرها في أواخر 1970s 1،2، هي الأداة الرئيسية لدراسة وظائف القناة الايونية واحدة أو متعددة في الأنسجة الحية. بين تكوينات التصحيح المختلفة التي يمكن تحقيقها، وتسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك تسمح دراسة السلوك الكهربائي لجزء كبير من الخلايا العصبية. تقليديا، يتم تنفيذ هذه التقنية في المختبر إما على شرائح الدماغ، الخلايا العصبية فصلها حديثا، أو على نماذج الثقافة الخلية 3. عندما أجريت على الخلايا العصبية في الدماغ شرائح، تقدم هذه التقنية العديد من المزايا. على وجه الخصوص: يتم تسجيل (ط) الخلايا العصبية في الدماغ الدوائر المحافظة نسبيا إلى حد ما، وبالمقارنة مع الاستعدادات زراعة الخلايا، وتوفير بيئة التي هي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية 3. وهذا يسمح التقاط وقت مبكر، أو حتى على الشاشة في الوقت الحقيقي، والأحداث الخلوية والجزيئية التي يتم تشغيلها من قبل أي نوع من pharmacolog الحادالتلاعب كال – قرار الزمني الذي لا يمكن تحقيقه باستخدام الكلاسيكية في ظروف الجسم الحي. (ب) القدرة على تحديد بصريا مناطق الدماغ في شرائح الدماغ تسمح خصوصية إقليمية عالية 3 على حد سواء لدراسة المنطقة الدماغ والخلايا العصبية محددة عندما يعبرون عن علامات الفلورسنت. (ج) الوصول إلى الفضاء داخل الخلايا من الخلية من خلال فتح جزء كبير من غشاء البلازما (على النقيض من ثقب غشاء مع micropipette حاد للتسجيلات داخل الخلايا) 4. في المقابل، وهذا يسمح للمحتوى أو تركيز أيونات معينة يؤلف الحل الداخلي إلى تعديل أهداف جزيئية ذلك أو الآليات الخلوية يمكن دراستها تحت ظروف مختلفة. على سبيل المثال، عند إنشاء تكوين خلية كاملة، أي وكيل الدوائية محددة (على سبيل المثال، الخصوم) التي يمكن للمرء أن يضيف إلى micropipette تسجيل (التصحيح ماصة) سوف حل منتشر مباشرة في سيتوبلازم وتتصرف على أساسها putat لهاإيف أهداف داخل الخلايا دون تغيير وظيفة الهدف في الخلايا المجاورة. بالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع تسجيل micropipette حاد، وفتح كبير في طرف القطب المشبك التصحيح يوفر أدنى مقاومة، والضوضاء أقل المتنافسة، وبالتالي تحسين فرص الكهربائية إلى داخل الخلية 4. ومع ذلك، لاحظ أن فتحة كبيرة في الطرف ماصة قد يؤدي إلى غسيل الكلى الخلايا، وبالتالي فقدان الآلية الجزيئية الخلايا التي قد تكون حاسمة للتعبير عن الظواهر البيولوجية التي هي تحت الدراسة 5،6. في هذه الحالة، قد تكون التسجيلات القطب حادة أكثر ملاءمة. هذا النوع من التسجيلات يتطلب بال micropipettes مع مسام أصغر بكثير من تلك المستخدمة للتسجيلات خلية كاملة، وبالتالي منع معظم التبادل الأيوني بين الفضاء داخل الخلايا والحل ماصة الداخلي.
أي شكل من أشكال الخبرة (حادة أو مزمنة)، بما في ذلك التعلم 7-10، والتعرض لتعاطي المخدرات 11،12، والإجهاد 13،14، وما إلى ذلك، يمكن أن يغير جوانب مختلفة من وظيفة الخلايا العصبية في مناطق محددة في الدماغ. لأن هذه التعديلات غالبا ما تتطلب وقتا لتطوير (ساعات إلى أيام)، وتسجيلات خلية كاملة في شرائح الدماغ من الحيوانات التي خضعت لتجربة محددة تسمح للباحثين التعرف على هذه التغييرات. في الأساس، فإن العديد (إن لم يكن كل) المكونات التي تشارك في وظائف الخلايا العصبية (مثل القنوات الأيونية تنشيط يجند، قنوات أيون الجهد مسور، النقل العصبي)، وبالتالي النشاط الدائرة الدماغ والسلوك، ويمكن أن تتغير من تجربة (تجربة تعتمد اللدونة) 10،15-17. على مستوى الخلايا العصبية، والنشاط الدائرة الدماغ يظهر من تفاعلات مستمرة بين متشابك (على سبيل المثال، نقل الغلوتامات) وعوامل استثارة الخلوية الذاتية (على سبيل المثال، وقنوات ايون axosomato شجيري: الصوديوم، الصوديوم، البوتاسيوم، K +، والكالسيوم، الكالسيوم 2+ ). في ظل ظروف معينة باستخدام مصنعونالبريد الخلية، التعديلات إشارة مصدرها على وجه التحديد من التغييرات في مقابل متشابك استثارة الجوهرية يمكن عزل التصحيح المشبك تقنيات الكهربية.
في معظم الحالات، يتم تقييم استثارة متشابك باستخدام خلية كاملة تقنية الجهد المشبك. يسمح هذا الوضع تسجيل قياس التيارات أيون [على سبيل المثال، بوساطة مستقبلات حمض α-أمينو-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-isoxazolepropionic ( مستقبلات أمبا) ومستقبلات N-ميثيل-D-الأسبارتيك حمض (مستقبلات NMDA)] من خلال غشاء البلازما الخلايا العصبية في حين الضغط على غشاء المحتملة في مجموعة الجهد. هنا، المجربون استخدام الحلول الداخلية micropipette التي تحتوي على مادة السيزيوم (جيم +)، مانع واسعة من K + قنوات (الرئيسية عوامل استثارة الجوهرية). على إنشاء تكوين خلية كاملة، ونشر جيم + في الفضاء داخل الخلايا كتلة K + القنوات، وبالتالي سيسمح كل من كفاءة نسبيا الفضاء المشبك وقبلتنفيس عن تأثير عوامل استثارة الجوهرية على قياسات أخرى. قضايا الفضاء المشبك، أي صعوبة في الجهد المشبك في خلية كاملة، تنشأ عند تسجيل الخلايا على شكل غير منتظم (على سبيل المثال، الخلايا العصبية)، وبشكل خاص الخلايا العصبية مع شجيري واسعة ومعقدة الشجرة 18،19. لأن الجسدية الجهد المشبك الضوابط سيئة الجهد في شجرة شجيري من الخلايا العصبية، مشوهة جوانب مختلفة من الإشارات الكهربائية الجذعية قيد الدراسة في الطريقة التي تعتمد على المسافة الجذعية. جنبا إلى جنب مع أدوات الدوائية مثل بيكروتوكسين (غاما الغاما حامض، GABA وخصم مستقبلات) أو حامض kynurenic (مانع واسعة من مستقبلات الغلوتامات) الذائب في حل خارج الخلية (الاصطناعي الدماغية الشوكي السائل، ACSF)، وهذا الأسلوب يسمح بقياس الغلوتامات مستقبلات GABA ووالتيارات R بوساطة التوالي.
في المقابل، وعادة ما يتم تقييمها استثارة الجوهرية في وضع تسجيل المشبك الحالي.بدلا من تسجيل الجهد المشبك، وهذا وضع تسجيل يسمح بقياس الاختلافات في إمكانات غشاء الناجمة عن التيارات أيون التي تتدفق من خلال غشاء البلازما الخلايا العصبية. عادة، يتم تقييم التغيير في استثارة الجوهرية من خلال التغييرات في القدرة على الخلايا العصبية لتوليد إمكانات العمل، الأمر الذي يتطلب على حد سواء نا + وقنوات K +. ولذلك، عند تنفيذ تسجيلات المشبك الحالي، تمتلئ بال micropipettes مع حل داخلي يحتوي على K + بدلا من جيم +. جنبا إلى جنب مع وكلاء الدوائية التي تمنع الغلوتامات وGABA والتيارات بوساطة مستقبلات الذائبة في ACSF، وهذا التصميم التجريبي يسمح قياس مساهمة العوامل الجوهرية (على سبيل المثال، K + قنوات) إلى إطلاق الخلايا العصبية دون أن الملوثة التغيرات المحتملة في استثارة متشابك العوامل.
هذه المادة سوف تصف الخطوات الإجرائية اللازمة الأساسية رس (ط) إعداد شرائح الدماغ صحية؛ (ب) تحقيق تكوين خلية كاملة، و (ج) مراقبة المعايير الأساسية لتقييم متشابك واستثارة الجوهرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول الإجراء الأساسي لأداء خلية كاملة التجارب التصحيح، المشبك على الخلايا العصبية في الدماغ شرائح. ومع ذلك، فإن التعقيد، وإمكانات وحساسية هذه التقنية لا يمكن وصفها بشكل كامل في هذه المقالة. هنا، حاولنا لتحديد الخطوات الأساسية وتؤكد المعالم الهامة الت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل صناديق بدء التشغيل UT جنوب غربي (SK).
Materials
| Isolated pulse stimulus generator | A.M.P.I | Master-8 | |
| Isolation unit (ISO-Flex) | A.M.P.I | ISO-Flex | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1500 | |
| Microscope | Olympus | BX-51 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-344B | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT1000 S | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Imaging Camera | Q Imaging | QIClick-F-M-12 | |
| Narishige pipette puller PC-10 | Narishige | PC-10 | |
| Glass capillaries | WPI | TW150F-3 | |
| Slice hold-down (harp) | Warner Instruments | 64-0255 | |
| Slice Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Nonmetallic syringe needle | World Precision Instruments | MF28G67-5 | |
| Syringe filters | Nalgene | 176-0045 | |
| Glue Gun | Home Depot | various | |
| Gas dispersion tube | Ace Glass Inc. | various | |
| Decapitation scissors | Home Depot | 100649198 | |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Small straight sharp tips scissors | World Precision Instruments | 14218 | |
| Vessel canulation forceps | World Precision Instruments | 500453 | |
| Curved hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501288 | |
| Economy Tweezers #3 | World Precision Instruments | 501976-6 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14357Q | |
| Scooping spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Filter paper | Lab Depot | CFP1-110 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| D-gluconic acid 50% | Sigma Aldrich/various | G1951 | |
| Cesium-OH (CsOH) 50% | Sigma Aldrich/various | 232041 | |
| NaCl, 2.8 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| HEPES, 20 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.4 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| tetraethylammonium-Cl, 5 mM | Sigma Aldrich/various | T2265 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| K D-gluconate, 120 mM | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KCl, 20 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| HEPES, 10 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.2 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M8266 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm) | |||
| KCl, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| NaCl, 119 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| NaH2PO4-H20, 1 mM | Sigma Aldrich/various | S9638 | |
| NaHCO3, 26.2 mM | Sigma Aldrich/various | S8875 | |
| Glucose, 11 mM | Sigma Aldrich/various | G8270 | |
| MgSO4-7H2O, 1.3 mM | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| CaCl2-2H20, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | C3881 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional compounds used for solutions preparation | |||
| KOH | various | ||
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich/various | K3375 | |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
- Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. J Neurophysiol. 67 (5), 1346-1358 (1992).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflugers Arch. 411 (2), 204-211 (1988).
- Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
- Kourrich, S., Bonci, A. Chapter 5: Synaptic and Neural plasticity. Neurobiology of Mental Illness. 4th edn. , (2013).
- Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory. Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).
- Zhang, W., Linden, D. J. The other side of the engram: experience-driven changes in neuronal intrinsic excitability. Nat Rev Neurosci. 4 (11), 885-900 (2003).
- Kourrich, S., Calu, D. J., Bonci, A. Intrinsic plasticity: an emerging player in addiction. Nat Rev Neurosci. 16 (3), 173-184 (2015).
- Luscher, C., Malenka, R. C. Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from molecular changes to circuit remodeling. Neuron. 69 (4), 650-663 (2011).
- McEwen, B. S., Morrison, J. H. The brain on stress: vulnerability and plasticity of the prefrontal cortex over the life course. Neuron. 79 (1), 16-29 (2013).
- Sandi, C., Haller, J. Stress and the social brain: behavioural effects and neurobiological mechanisms. Nat Rev Neurosci. 16 (5), 290-304 (2015).
- Kim, S. J., Linden, D. J. Ubiquitous plasticity and memory storage. Neuron. 56 (4), 582-592 (2007).
- Ganguly, K., Poo, M. M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
- Kullmann, D. M., Moreau, A. W., Bakiri, Y., Nicholson, E. Plasticity of inhibition. Neuron. 75 (6), 951-962 (2012).
- Bar-Yehuda, D., Korngreen, A. Space-clamp problems when voltage clamping neurons expressing voltage-gated conductances. J Neurophysiol. 99 (3), 1127-1136 (2008).
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 11 (7), 790-798 (2008).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-131 (1992).
- Defelice, L. J. . Electrical Properties of Cells-Patch Clamp for Biologists. , (1997).
- Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. J Vet Cardiol. 9 (1), 25-37 (2007).
- Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
- Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Sci Am. 266 (3), 44-51 (1992).
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J Neurosci Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J Neurosci Methods. 158 (2), 251-259 (2006).
- Kourrich, S., et al. Dynamic interaction between sigma-1 receptor and Kv1.2 shapes neuronal and behavioral responses to cocaine. Cell. 152 (1-2), 236-247 (2013).
- Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward. J Neurosci. , (2012).
- Kourrich, S., Rothwell, P. E., Klug, J. R., Thomas, M. J. Cocaine experience controls bidirectional synaptic plasticity in the nucleus accumbens. J Neurosci. 27 (30), 7921-7928 (2007).
- Kourrich, S., Thomas, M. J. Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell. J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).
- Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Environmental novelty causes stress-like adaptations at nucleus accumbens synapses: implications for studying addiction-related plasticity. Neuropharmacology. 61 (7), 1152-1159 (2011).
- Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse. Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).
- Koya, E., et al. Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization. Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording. Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).
- Novak, P., et al. Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels. Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).
