Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Summary

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Abstract

Whole-cell patch-clamp is een elektrofysiologische techniek die de studie van de elektrische eigenschappen van een aanzienlijk deel van het neuron toelaat. In deze configuratie is de micropipet in nauw contact met de celmembraan, welke lekstroom nauwkeuriger ionische stroommetingen voorkomt en op basis waarvan voorheen de intracellulaire scherpe elektrode opnamemethode. Klassiek kunnen whole-cell opname worden uitgevoerd op neuronen in verschillende soorten preparaten, waaronder celkweekmodellen, gedissocieerd neuronen, neuronen in hersencoupes, en intact verdoofde of wakkere dieren. Samenvattend heeft deze techniek veel bijgedragen aan het begrip van passieve en actieve biofysische eigenschappen van exciteerbare cellen. Een groot voordeel van deze techniek is dat het voorziet in informatie over hoe specifieke manipulaties (bijvoorbeeld farmacologische, experimentator-geïnduceerde plasticiteit) kunnen specifieke neuronale functies of c veranderenhannels in real-time. Bovendien significante openstelling van het plasmamembraan kan de interne pipetoplossing vrij diffunderen in het cytoplasma, verschaffende middelen voor het inbrengen van geneesmiddelen, bijvoorbeeld agonisten of antagonisten van specifieke intracellulaire eiwitten en manipuleren van deze doelen zonder dat hun functie in naburige cellen. Dit artikel zal zich richten op whole-cell opname uitgevoerd op neuronen in de hersenen plakjes, een preparaat dat het voordeel van het opnemen van neuronen in relatief goed bewaard gebleven hersenen circuits, dat wil zeggen, in een fysiologisch relevante context heeft. Vooral in combinatie met geschikte farmacologie, deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de identificatie van specifieke neuroadaptations die zich na elk type ervaringen, zoals leren, blootstelling aan drugs en stress. Samengevat, whole-cell patch-clamp opnamen in de hersenen plakjes bieden middelen om te meten in ex vivo bereiding langdurige veranderingenin neuronale functies die zijn ontstaan ​​bij intacte dieren wakker.

Introduction

De patch-clamp techniek elektrofysiologisch techniek die is ontwikkeld in de late jaren 1970 ^1,2, is een primair middel voor het bestuderen van enkele of meervoudige ionkanaal functioneert in levend weefsel. Van de verschillende patch configuraties die kunnen worden bereikt, whole-cell patch-clamp kan de studie van het elektrisch gedrag van een aanzienlijk deel van het neuron. Klassiek wordt deze techniek uitgevoerd in vitro hetzij hersencoupes, net losgemaakte neuronen, of celkweekmodellen ^3. Wanneer uitgevoerd op neuronen in hersencoupes Deze techniek biedt verschillende voordelen. Met name: (i) neuronen worden in relatief geconserveerde hersenen circuits die tot op zekere hoogte, en vergeleken met celkweek preparaten bieden een omgeving die fysiologisch relevant ^3. Hierdoor kunnen vastleggen vroeg of zelfs controle in real time, cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die worden geactiveerd door een soort acute pharmacologsche manipulaties – een tijdsresolutie die niet kunnen worden bereikt met behulp van klassieke in vivo omstandigheden; (ii) het vermogen om visueel hersengebieden te identificeren in de hersenen plakjes maakt hoge regionale specificiteit ³ zowel voor de hersenen regio bestudeerd en specifieke neuronen wanneer ze uiten fluorescerende markers; (iii) de toegang tot de intracellulaire ruimte van de cel door het openen van een aanzienlijk deel van het plasmamembraan (in tegenstelling tot het membraan doorboren met een scherp micropipet voor intracellulaire recordings) ^4. Op zijn beurt kan het gehalte of concentratie van specifieke ionen samenstellen van de interne oplossing worden gemodificeerd moleculaire doelwitten of cellulaire mechanismen kunnen worden bestudeerd onder verschillende condities. Bijvoorbeeld bij vaststelling whole-cell configuratie, een specifiek farmacologisch middel (bijvoorbeeld antagonisten) die men kan toevoegen aan de opname micropipet (patch pipet) oplossing direct verspreiden in het cytoplasma en borg staan ​​putative intracellulaire doelen zonder de doelfunctie in naburige cellen. Bovendien, vergeleken met scherpe micropipet opname, de grote opening aan het uiteinde van de patch clamp elektrode biedt lagere weerstand, minder tegenstrevers ruis, en dus betere elektrische naar het binnenste van de cel ^4. Merk echter op dat de grote opening bij de pipetpunt kan leiden tot cel dialyse, en daarmee het verlies van intracellulaire moleculaire machinerie die essentieel zijn voor de expressie van de biologische verschijnselen die worden bestudeerd ^5,6 zijn. In dit geval kan scherpe elektrode opnames meer geschikt. Dergelijke opnames nodig micropipetten met een porie die is veel kleiner dan die voor whole-cell opnames, waarbij de meeste van de ionenuitwisseling tussen intracellulaire ruimte en de interne pipetoplossing voorkomen.

Elke vorm van ervaring (acuut of chronisch), met inbegrip van het leren van ^7-10, de blootstelling aan drugs ^11,12, stress ^13,14, enz, kunnen diverse aspecten van neuronale functie in specifieke hersengebieden veranderen. Omdat deze veranderingen vereisen vaak tijd om te ontwikkelen (uren tot dagen), whole-cell opnames in hersenen plakjes zijn van dieren die een specifieke ervaring hebben ondergaan kunnen onderzoekers dergelijke veranderingen detecteren. In principe vele (zo niet alle) componenten die deelnemen in neuronale functies (bijvoorbeeld ligand-geactiveerde ionkanalen, voltage-gated ionkanalen, neurotransmitter transporters), en daardoor de hersenen circuit activiteit en gedrag kan worden gewijzigd door ervaring (ervaringsafhankelijke plasticiteit) ^10,15-17. Op het neuronale niveau, de hersenen circuit activiteit blijkt uit een constante interactie tussen synaptische (bijvoorbeeld glutamaat transmissie) en de intrinsieke cellulaire prikkelbaarheid factoren (bijvoorbeeld axosomato-dendritische ionkanalen: natrium, Na ^+, kalium, K ^+, en calcium, Ca ²⁺ ). Onder bepaalde voorwaarden het gebruik van groe-cell patch-clamp elektrofysiologische technieken, signaal veranderingen in het bijzonder afkomstig van de veranderingen in de synaptische versus intrinsieke prikkelbaarheid kan worden geïsoleerd.

Meestal wordt synaptische exciteerbaarheid vastgesteld met behulp van gehele-cel voltage-clamp techniek. Deze opname modus kan het meten van ionenstromen [bijvoorbeeld gemedieerd door α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptoren ( AMPA-receptoren) en N-methyl-D-asparaginezuur receptoren (NMDA-receptoren)] door het neuronale plasmamembraan terwijl de membraanpotentiaal op een ingestelde spanning. Hier, onderzoekers maken gebruik van interne micropipet oplossingen die cesium bevatten (Cs ^+), een brede blocker van K ⁺ kanalen (key intrinsieke prikkelbaarheid factoren). Bij de oprichting van whole-cell configuratie, zal de verspreiding van Cs ⁺ in de intracellulaire ruimte blok K ⁺ kanalen, en daarbij zal zowel een relatief efficiënte ruimte-klem en pre toestaanvent invloed van intrinsieke exciteerbaarheid factoren andere metingen. Space-clamp kwesties, dat wil zeggen, de moeilijkheid om voltage-clamp de gehele cel, ontstaan ​​bij het ​​opnemen van onregelmatig gevormde cellen (bijvoorbeeld neuronen), en in het bijzonder neuronen met een grote en complexe dendritische prieel ^18,19. Omdat somatische voltage clamp slecht controles spanning in de dendritische boom van neuronen worden verschillende aspecten van de dendritische elektrische signalen in studie vertekend in een dendritische afstand-afhankelijke manier. Gecombineerd met farmacologische hulpmiddelen zoals picrotoxine (gamma-aminoboterzuur, _{GABAA-receptorantagonist)} of kynureenzuur (breed blokker van glutamaatreceptoren) opgelost in extracellulaire oplossing (kunstmatige cerebrospinale vloeistof, ACSF), deze techniek kan de meting van glutamaat receptor respectievelijk GABA _A-R gemedieerde.

In tegenstelling, is de intrinsieke prikkelbaarheid gewoonlijk beoordeeld in de huidige-clamp opnamemodus.In tegenstelling tot voltage-clamp deze opnamestand maakt de meting van variaties in membraanpotentialen geïnduceerd door ionen stromen die door de neuronale plasmamembraan. Typisch wordt verandering intrinsieke exciteerbaarheid bepaald door veranderingen in het vermogen van neuronen actiepotentialen, die zowel Na ⁺ en K ⁺ kanalen vereist genereren. Dus bij het ​​uitvoeren stroom-clamp, micropipetten zijn gevuld met een interne oplossing die K ⁺ in plaats van Cs ⁺ bevat. Gecombineerd met farmacologische middelen die glutamaat en GABA blok _A-receptor gemedieerde opgelost in ACSF, deze experimentele ontwerp maakt de meting van de bijdrage van intrinsieke factoren (bijvoorbeeld K ⁺ kanalen) aan neuronale zonder besmetting door potentiële veranderingen in synaptische exciteerbaarheid factoren.

Dit artikel zal de fundamentele nodige procedurele stappen te beschrijven to (i) bereiden gezonde hersenen plakjes; (Ii) bereiken whole-cell configuratie, en (iii) toezien basisparameters synaptische en intrinsieke exciteerbaarheid beoordelen.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens protocollen van UT Southwestern Institutional Animal Care en gebruik goedgekeurde uitgevoerd en werden gekozen om stress, ongemak en pijn die de proefdieren minimaliseren. 1. Oplossingen Let op: Bereid micropipet interne oplossingen op voorhand. Voor de meeste elementaire experimentele doeleinden worden gebruikt, moeten twee soorten oplossingen volstaan: Cs + -gebaseerde en K + -gebaseerde oplossingen. Gebruik Cs + -g…

Representative Results

Temperatuur, een factor die gemakkelijk wordt gecontroleerd door de experimentator, beïnvloedt de biofysische eigenschappen van ionkanalen en receptoren en daardoor de golfvorm van postsynaptische stroom (PSC) (EPSC en iPSCs) en het vermogen van neuronen pieken wekken. Figuur 3 en figuur 4 tonen het effect van temperatuur op neuronale en de helling van opgeroepen EPSCs (eEPSCs) respectievelijk. De reeks flitsen (Figuur 3) (dwz …

Discussion

Dit protocol wordt de basisprocedure voor het uitvoeren whole-cell patch-clamp experimenten aan neuronen in hersencoupes. Echter, de complexiteit en mogelijke gevoeligheid van deze techniek kan niet worden volledig beschreven in dit artikel. Hier hebben we geprobeerd om de meest elementaire stappen af ​​te bakenen en onderstrepen belangrijke parameters die moeten worden gecontroleerd voor het bereiken van een succesvolle en strenge whole-cell opnames. Voor verdere theoretisch leren, hebben veel boeken en artikelen g…

Materials

Isolated pulse stimulus generator	A.M.P.I	Master-8
Isolation unit (ISO-Flex)	A.M.P.I	ISO-Flex
Computer controlled Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Digital Acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1500
Microscope	Olympus	BX-51
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-344B
Vibratome Slicer	Leica	VT1000 S
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Imaging Camera	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Narishige pipette puller PC-10	Narishige	PC-10
Glass capillaries	WPI	TW150F-3
Slice hold-down (harp)	Warner Instruments	64-0255
Slice Chamber	Warner Instruments	RC-26
Nonmetallic syringe needle	World Precision Instruments	MF28G67-5
Syringe filters	Nalgene	176-0045
Glue Gun	Home Depot	various
Gas dispersion tube	Ace Glass Inc.	various
Decapitation scissors	Home Depot	100649198
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Small straight sharp tips scissors	World Precision Instruments	14218
Vessel canulation forceps	World Precision Instruments	500453
Curved hemostatic forceps	World Precision Instruments	501288
Economy Tweezers #3	World Precision Instruments	501976-6
Spatula	Fisher Scientific	14357Q
Scooping spatula	Fisher Scientific	14-357Q
Petri dish	Fisher Scientific	08-747B
Filter paper	Lab Depot	CFP1-110
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
D-gluconic acid 50%	Sigma Aldrich/various	G1951
Cesium-OH (CsOH) 50%	Sigma Aldrich/various	232041
NaCl, 2.8 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
HEPES, 20 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.4 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
tetraethylammonium-Cl, 5 mM	Sigma Aldrich/various	T2265
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
K D-gluconate, 120 mM	Sigma Aldrich/various	G4500
KCl, 20 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
HEPES, 10 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.2 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M8266
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
NaCl, 119 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
NaH2PO4-H20, 1 mM	Sigma Aldrich/various	S9638
NaHCO3, 26.2 mM	Sigma Aldrich/various	S8875
Glucose, 11 mM	Sigma Aldrich/various	G8270
MgSO4-7H2O, 1.3 mM	Sigma Aldrich/various	230391
CaCl2-2H20, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	C3881
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Additional compounds used for solutions preparation
KOH	various
Kynurenic acid	Sigma Aldrich/various	K3375