Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette
Summary
Questo protocollo descrive passaggi procedurali di base per l'esecuzione di cellule intere registrazioni patch-clamp. Questa tecnica consente di studiare il comportamento elettrico dei neuroni, e quando eseguito in sezioni di cervello, permette di valutare diverse funzioni neuronali da neuroni che sono ancora integrati in circuiti cerebrali relativamente ben conservati.
Abstract
Whole-cell patch-clamp registrazione è una tecnica elettrofisiologica che permette lo studio delle proprietà elettriche di una parte sostanziale del neurone. In questa configurazione, la micropipetta è a stretto contatto con la membrana cellulare, che impedisce la dispersione di corrente e quindi fornisce misure di corrente ionica più preciso del metodo di registrazione elettrodo affilato intracellulare precedentemente utilizzato. Classicamente, la registrazione a cellula intera può essere eseguita su neuroni in vari tipi di preparati, compresi i modelli di colture cellulari, i neuroni dissociate, i neuroni in fettine di cervello, e in animali anestetizzati o sveglio intatte. In sintesi, questa tecnica ha enormemente contribuito alla comprensione della passivi e attivi proprietà biofisiche di cellule eccitabili. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che fornisce informazioni sulle modalità specifiche manipolazioni (ad esempio, farmacologico, sperimentatore indotta plasticità) possono alterare le funzioni neuronali specifici ochannels in tempo reale. Inoltre, significativa apertura della membrana plasmatica permette alla soluzione pipetta interna di diffondersi liberamente nel citoplasma, predisporre mezzi per farmaci introduzione, ad esempio, agonisti o antagonisti di specifiche proteine intracellulari, e manipolare tali obiettivi senza alterare le loro funzioni in cellule vicine. Questo articolo si concentrerà sulla registrazione a cellula intera eseguita su neuroni in fettine cerebrali, una preparazione che ha il vantaggio di registrazione neuroni relativamente ben conservati circuiti cerebrali, cioè in un contesto fisiologicamente rilevanti. In particolare, quando combinato con adeguate farmacologia, questa tecnica è uno strumento potente che consente di identificare neuroadaptations specifici che si sono verificati in seguito a qualsiasi tipo di esperienze, quali l'apprendimento, l'esposizione a sostanze d'abuso, e lo stress. In sintesi, le registrazioni a cellula intera patch-clamp in fettine di cervello forniscono i mezzi per misurare in ex vivo preparazione cambiamenti duraturinelle funzioni neuronali che si sono sviluppate negli animali svegli intatti.
Introduction
La tecnica del patch-clamp, una tecnica elettrofisiologica che è stato sviluppato alla fine del 1970 1,2, è uno strumento primario per studiare le funzioni di uno o più canali ionici nel tessuto vivo. Tra le diverse configurazioni di patch che si possono ottenere, registrazioni whole-cell patch-clamp permettono lo studio del comportamento elettrico di una parte sostanziale del neurone. Classicamente, questa tecnica viene eseguita in vitro sia su fettine cerebrali, neuroni appena dissociate, o su modelli di coltura cellulare 3. Quando eseguito sui neuroni in fettine cerebrali, questa tecnica presenta diversi vantaggi. In particolare: (i) i neuroni sono registrati nei circuiti cerebrali relativamente conservate che in qualche misura, e rispetto alle preparazioni di coltura cellulare, forniscono un ambiente che è fisiologicamente rilevanti 3. Questo permette di catturare in anticipo, o anche il monitoraggio in tempo reale, gli eventi cellulari e molecolari che sono attivati da qualsiasi tipo di pharmacolog acutamanipolazioni iCal – una risoluzione temporale che non può essere raggiunto utilizzando classica in condizioni in vivo; (ii) capacità di identificare visivamente le regioni del cervello in fettine di cervello permette un'elevata specificità regionale 3 sia per la regione del cervello studiato e per i neuroni specifici quando esprimono marcatori fluorescenti; (iii) l'accesso allo spazio intracellulare della cellula aprendo una porzione significativa della membrana plasmatica (in contrasto pungere la membrana con una micropipetta tagliente per le registrazioni intracellulari) 4. A sua volta, questo consente al contenuto o la concentrazione di ioni specifici che compongono la soluzione interna da modificare bersagli molecolari modo o meccanismi cellulari possono essere studiati in condizioni diverse. Ad esempio, su di stabilire cellula intera configurazione, qualsiasi agente farmacologico specifico (ad esempio, gli antagonisti) che si può aggiungere alla micropipetta di registrazione (patch pipetta) soluzione sarà direttamente diffondersi nel citoplasma e di agire sul suo putative bersagli intracellulari senza alterare la funzione obiettivo in cellule vicine. Inoltre, rispetto alla registrazione micropipetta tagliente, la grande apertura sulla punta dell'elettrodo patch clamp offre minore resistenza, meno rumore CONCORRENTI, e quindi un migliore accesso elettrico all'interno della cella 4. Si noti tuttavia che l'ampia apertura sulla punta della pipetta può portare alla dialisi cellule, e quindi la perdita di macchinario molecolare intracellulare che può essere critico per l'espressione dei fenomeni biologici che sono in fase di studio 5,6. In questo caso, le registrazioni elettrodo taglienti può essere più adatto. Questo tipo di registrazioni richiede micropipette con un poro che è molto più piccolo di quelli usati per le registrazioni cellule intere, impedendo così la maggior parte lo scambio ionico tra lo spazio intracellulare e la soluzione pipetta interna.
Ogni forma di esperienza (acuta o cronica), compreso l'apprendimento 7-10, l'esposizione a sostanze d'abuso 11,12, lo stress 13,14, ecc, possono alterare i vari aspetti della funzione neuronale in regioni specifiche del cervello. Poiché queste alterazioni spesso richiedono tempo per svilupparsi (ore o giorni), le registrazioni integrali delle cellule in fettine di cervello da animali che sono stati sottoposti a una specifica esperienza permettono ai ricercatori di identificare questi cambiamenti. In sostanza, molti (se non tutti) i componenti che partecipano nelle funzioni neuronali (per esempio, ligando-attivato canali ionici, canali ionici voltaggio-dipendenti, trasportatori neurotrasmettitori), e in tal modo l'attività del circuito del cervello e del comportamento, può essere alterato da esperienza (l'esperienza-dipendente plasticità) 10,15-17. A livello neuronale, l'attività circuito cerebrale emerge dalle interazioni costanti tra sinaptica (ad esempio, trasmissione glutammato) e fattori intrinseci eccitabilità cellulare (per esempio, canali ionici axosomato-dendritica: sodio, Na +, potassio, K +, e di calcio, Ca 2+ ). In condizioni specifiche che utilizzano da tE-CELL patch-clamp tecniche elettrofisiologiche, alterazioni di segnale provenienti in particolare da variazioni sinaptica vs. eccitabilità intrinseca può essere isolato.
Nella maggior parte dei casi, l'eccitabilità sinaptica è valutato utilizzando la tecnica voltage-clamp whole-cell. Questa modalità di registrazione permette la misura di correnti ioniche [ad esempio, mediati dai recettori di acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionic ( recettori AMPA) e recettori N-metil-D-aspartico (NMDA)] attraverso la membrana plasmatica neuronale, mentre tengono il potenziale di membrana ad una tensione impostata. Qui, sperimentatori utilizzano le soluzioni interne micropipetta contenenti cesio (Cs +), una vasta bloccanti di canali K + (chiave fattori intrinseci eccitabilità). Su creazione di cellula intera configurazione, la diffusione di Cs + nello spazio intracellulare bloccherà canali K +, e quindi permetterà sia relativamente efficiente spazio-clamp e presfogare influenza dei fattori intrinseci eccitabilità su altre misure. Problemi di spazio-clamp, cioè, la difficoltà di tensione-clamp tutta la cella, sorgono quando si registra cellule di forma irregolare (ad esempio, neuroni), e in particolare neuroni con un vasto e complesso dendritic arbor 18,19. Poiché morsetto tensione somatica controlli scarsamente voltaggio nella struttura dendritica dei neuroni, vari aspetti dei segnali elettrici dendritiche in esame sono distorti in maniera dendritica distanza-dipendente. Combinato con strumenti farmacologici come picrotoxin (acido gamma-aminobutirrico, GABA A antagonista del recettore) o acido kinurenico (ampio bloccante dei recettori del glutammato) disciolti nella soluzione extracellulare (fluido cerebro-spinale artificiale, ACSF), questa tecnica permette di misurare glutammato recettore e le correnti GABA A R-mediata, rispettivamente.
Al contrario, l'eccitabilità intrinseca viene generalmente valutato in modalità di registrazione corrente-clamp.Al contrario di registrazione voltage-clamp, questa modalità di registrazione permette la misura delle variazioni potenziali di membrana indotte da correnti ioniche che fluisce attraverso la membrana plasmatica neuronale. Tipicamente, alterazione dell'eccitabilità intrinseca è valutata attraverso cambiamenti nella capacità di neuroni di generare potenziali d'azione, che richiede sia Na + e canali del K +. Pertanto, quando si eseguono registrazioni corrente-clamp, micropipette sono riempiti con una soluzione interna che contiene K + anziché Cs +. In combinazione con agenti farmacologici che bloccano glutammato e GABA A correnti recettoriali disciolti nel ACSF, questo disegno sperimentale permette la misura del contributo di fattori intrinseci (ad esempio, K + canali) a neuronale senza essere contaminati da potenziali variazioni dell'eccitabilità sinaptica fattori.
Questo articolo descrive i passi procedurali necessari di base to (i) prepara fette di cervello sane; (Ii) ottenere cellula intera configurazione, e (iii) monitorare i parametri fondamentali per valutare sinaptica e l'eccitabilità intrinseca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive la procedura di base per l'esecuzione di cellule intere esperimenti di patch-clamp su neuroni in fettine di cervello. Tuttavia, la complessità, il potenziale e la sensibilità di questa tecnica non possono essere completamente descritti in questo articolo. Qui, abbiamo cercato di delineare i passaggi più elementari e sottolineare parametri importanti che devono essere controllati per ottenere registrazioni cellule intere di successo e rigorose. Per ulteriori apprendimento teorico, molti …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da UT Southwestern fondi di avvio (SK).
Materials
| Isolated pulse stimulus generator | A.M.P.I | Master-8 | |
| Isolation unit (ISO-Flex) | A.M.P.I | ISO-Flex | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1500 | |
| Microscope | Olympus | BX-51 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-344B | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT1000 S | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Imaging Camera | Q Imaging | QIClick-F-M-12 | |
| Narishige pipette puller PC-10 | Narishige | PC-10 | |
| Glass capillaries | WPI | TW150F-3 | |
| Slice hold-down (harp) | Warner Instruments | 64-0255 | |
| Slice Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Nonmetallic syringe needle | World Precision Instruments | MF28G67-5 | |
| Syringe filters | Nalgene | 176-0045 | |
| Glue Gun | Home Depot | various | |
| Gas dispersion tube | Ace Glass Inc. | various | |
| Decapitation scissors | Home Depot | 100649198 | |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Small straight sharp tips scissors | World Precision Instruments | 14218 | |
| Vessel canulation forceps | World Precision Instruments | 500453 | |
| Curved hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501288 | |
| Economy Tweezers #3 | World Precision Instruments | 501976-6 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14357Q | |
| Scooping spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Filter paper | Lab Depot | CFP1-110 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| D-gluconic acid 50% | Sigma Aldrich/various | G1951 | |
| Cesium-OH (CsOH) 50% | Sigma Aldrich/various | 232041 | |
| NaCl, 2.8 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| HEPES, 20 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.4 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| tetraethylammonium-Cl, 5 mM | Sigma Aldrich/various | T2265 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| K D-gluconate, 120 mM | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KCl, 20 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| HEPES, 10 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.2 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M8266 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm) | |||
| KCl, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| NaCl, 119 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| NaH2PO4-H20, 1 mM | Sigma Aldrich/various | S9638 | |
| NaHCO3, 26.2 mM | Sigma Aldrich/various | S8875 | |
| Glucose, 11 mM | Sigma Aldrich/various | G8270 | |
| MgSO4-7H2O, 1.3 mM | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| CaCl2-2H20, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | C3881 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional compounds used for solutions preparation | |||
| KOH | various | ||
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich/various | K3375 | |
References
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